Очистка белков от низкомолекулярных примесей.

Для удаления низкомолекулярных соединений, в частности сульфата аммония после высаливания, применяют диализ. Метод основан на том, что через полупроницаемую мембрану, пропускающую низкомолекулярные вещества, не проходят белки, имеющие более высокую молекулярную массу. В стакан большой ёмкости (около 1 л) с буферным раствором помещают полупроницаемый мешочек, заполненный раствором белка с солью.

Скорость выхода соли из мешочка в буферный раствор пропорциональна градиенту его концентраций по обе стороны от мембраны. По мере выхода соли из мешочка буферный раствор в стакане меняют.

Для очистки белков от низкомолекулярных примесей используют также метод гель-фильтрации (см. выше) и ультрафильтрации. Последняя основана на продавливании растворов белка через специальные мембраны, задерживающие белковые молекулы, что позволяет не только освободить белковые растворы от низкомолекулярных примесей, но и концентрировать их. Если подобрать мембрану с таким размером пор, что через нее будут проходить не очень крупные белки, а большие белковые молекулы будут задерживаться, то ультрафильтрация может служить для фракционирования белков.

Для определения частоты (гомогенности) выделенного белка применяют методы с высокой разрешающей способностью, например электрофорез в полиакриламидном геле, высокоэффективная хроматография высокого давления. От чистоты лекарственного белкового препарата зависят его биологическая эффективность и аллергенность (т.е. способность вызывать аллергические реакции). Чем качественнее очищен препарат, тем меньше вероятность осложнений при его применении.

 

Классификация простых белков

Белки в зависимости от химического строения делят на простые и сложные. Простые белки при гидролизе распадаются только на аминокислоты. При гидролизе сложных белков наряду с аминокислотами образуется вещество небелковой природы – простетическая группа. Классификация простых белков основана на их растворимости.

Альбумины – водорастворимые белки с высокой гидрофильностью, выпадают в осадок при 100%-ом насыщении сульфатом аммония. Это группа схожих белков плазмы крови с молекулярной массой около 40-70 кДа, содержат много глутаминовой кислоты и поэтому имеют кислые свойства и высокий отрицательный заряд при физиологических рН. Легко адсорбируют полярные и неполярные молекулы, являются, белком-транспортером в крови для многих веществ, в первую очередь для билирубина и длинноцепочечных жирных кислот. К этим белкам относятся белок куриного яйца, белки зародыша семян злаковых и бобовых культур. Альбумины содержат все незаменимые аминокислоты.

Глобулины – растворяются в солевых растворах, чаще всего для извлечения глобулинов используют 2 –10%-ый раствор хлорида натрия. Они осаждаются 50%-ым раствором сульфата аммония. Это группа разнообразных белков плазмы крови с молекулярной массой 100-150 и более кДа, слабокислые или нейтральные. Они слабо гидратированы, по сравнению с альбуминами меньше устойчивы в растворе и легче осаждаются, Белки семян бобовых и масличных культур в основном представлены глобулинами; легумин – гороха и чечевицы, фазеолин – фасоли; глицин – соевых бобов. Они составляют почти половину белков крови человека, определяют иммунные свойства организма (иммуноглобулины), свертываемость крови (протромбин, фибриноген), участвуют в переносе железа к тканям и других процессах.

Многие альбумины и глобулины обладают ферментативным действием.

Проламины. Эта группа белков характерна исключительно для семян злаков. Характерной особенностью проламинов является растворимость в 60–80% водном растворе этанола, в то время как все остальные простые белки в этих условиях обычно выпадают в осадок. Эти белки содержат значительные количества пролина и глютаминовой кислот. Лизина они не содержат или содержат его в следовых количествах. Хорошо изучены проламины пшеницы – глиадины, ячменя – гордеин, кукурузы – зеин. Проламины – это комплексы белков различающиеся по составу и молекулярной массе.

Глутелины находятся, как правило, с проламинами. Эти белки тоже содержат значительные количества глютаминовой кислот, а значит относятся к кислым белкам. Растворяются они в щелочах (чаще 0,2%-ым NaOH). Глутелины не однородные белки, а смеси разных белков со сходными свойствами. Наиболее исследованы глутелин пшеницы, орезенин риса.

Глутенин и глиадин пшеницы образуют комплекс, который называют клейковиной. Клейковина муки влияет на структурно-механические свойства теста, а следовательно на качество хлеба.

Протамины – самые низкомолекулярные белки. Встречаются эти белки в молоках рыб. На 2/3 эти белки состоят из аргинина, поэтому имеют основной характер. Протамины не содержат серы.

Гистоны также являются белками основного характера. В их состав входят лизин и аргинин, содержание которых, однако, не превышает 20–30%.Гистоны – содержаться в хромосомах клеточных ядер, они участвуют в стабилизации пространственной структуры ДНК. Из растворов их осаждают аммиаком.