Калибровка

8. Ввести раствор первого белка в инжектор (до появления на выходе трубки 4).

9. Переключить инжектор на ввод в колонку (VALVE 1.2 DO/STORE).

10. Включить протяжку бумаги на самописце 2 мм/мин (= ___ мл/мм).

11. Через 1 мин перевести инжектор в исходное состояние (VALVE 1.1 DO/STORE)

12. Вести регистрацию 20-30 мин. до возврата пера до нулевой линии.

13. Повторить пункты 8-12 для второго белка и для исследуемой пробы.

14. Определить свободный объем колонки, используя раствор декстрана.

15. Построить калибровку (зависимость К от logМ), используя полученное значение свободного объема.

 

 

Задание по группам

Группа.	Калибровочный белок №1	Калибровочный белок №2	Определяемый белок
	Фибриноген,.....кД	Гемоглобин,.....кД	ЛДГ,.....кД
	Фибриноген,.....кД	Гемоглобин,.....кД	Альбумин бычий,.....кД
	Фибриноген,.....кД	Трипсин,.....кД	Гемоглобин,.....кД
	Гемоглобин,.....кД	Трипсин,.....кД	Альбумин бычий,.....кД
	ЛДГ,.....кД	Гемоглобин,.....кД	Альбумин бычий,.....кД

 

K=(V_e-V₀)/V_s, где

V_t - общий объем колонки =

V₀ – холостой объем, по выходу декстрана =

V_s – объем геля = V_t-V₀ =

V_e – объем выхода белка, =

K₁ =

K₂ =

K₃ =

 

Самостоятельная работа

1. Принципы методов определения молекулярной массы.

2. Понятие о других физических методах, которые используются для определения размера и формы частиц.

3. Какие факторы определяют скорость движения молекулы при ультрацентрифугировании. Характер зависимости.

4. Какие факторы определяют скорость движения молекулы при электрофорезе. Характер зависимости.

5. Теоретические основы гель-хроматографии. Выбор адекватного носителя для определения молекулярной массы.

6. Методика определения молекулярной массы с помощью гель-хроматографии.

7. Основные элементы жидкостного хроматографа.

8. Что такое холостой объем колонки и как его определить?

9. Как рассчитать общий объем колонки?

10. Что такое элюент, элюат?

 

Литература

· Скоупс Р. Методы очистки белков.– «Мир»: М., 1985

· Фрайфелдер Д. Физическая биохимия. – «Мир»: М., 1980

· Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. Наука: М., 1985, с.109-112, 145-162

 

 

ЗАНЯТИЕ № 2 (лабораторная работа)

ТЕМА: Определение количества и состояния заряженных групп белков методом потенциометрического титрования

Цель: Получить практические навыки исследования кислотно-основных свойств биологических молекул

Вопросы для рассмотрения на занятии:

1. Кислотно-основные свойства аминокислот.

2. Кислотно-основные свойства белков.

3. Выполнение практической работы по определению количества и состояния заряженных групп белков с помощью титратора VIT90.

 

Практическая работа:

Реактивы и оборудование: Видеотитратор VIT90, растворы белков (альбумин, трипсин, гемоглобин) в концентрации 10 мг/мл, физраствор (NaCl 0,9%), 0,1М раствор HCl, 0,05М раствор NaOH, мерный цилиндр 50 мл, дозатор 0,1 мл.

1. Ознакомление с элементами управления титратора (с помощью преподавателя). Обратите внимание, что кроме клавиатуры, следует использовать и клавиши с переменной функцией (появляются соответствующие надписи на экране.

2. Включить VIT90 и блок бюреток.

3. Промыть электроды дистиллированной водой и просушить фильтровальной бумагой.

4. Войти в режим выбора программы измерения (клавиша INDEX).

5. Выбрать программу 0 (тип измерения CURVE – регистрация кривой).

6. Заполнить измерительную кювету 20 мл физраствора.

7. Добавить 0,3 мл раствора белка.

8. Добавить 0,1-0,2 мл HCl, рН должен быть около 3.

9. Нажимая последовательно BEGIN, RUN запустить программу измерения.

10. После окончания титрования зарисовать характер кривой и запротоколировать данные (нажать клавишу ALL POINTS).

11. Используя справочные данные, определите какие группы соответствуют отдельным особым точкам на кривой.

12. Используя данные протокола, оцените количество определяемых групп.

Таблица 13.1 Значения рК для некоторых аминокислот

	Аминокислота	рК
	Аргинин
	Аспарагиновая кислота
	Глутаминовая кислота
	Гистидин
	Лизин
	Тирозин

 

Задание по группам

Группа	Определяемый белок	Особые точки	Аминокислотные остатки	Количество групп
	Гемоглобин
	Альбумин бычий
	Трипсин

 

Самостоятельная работа

1. Что такое потенциометрическое титрование.

2. Физический смысл pK.

3. рК аминокислот.

4. Какими факторами определяется количество титруемых групп белков.

 

Литература

· Чанг Р. Физическая химия с приложениями к биологическими системам. М.: «Мир», 1980

 

 

ЗАНЯТИЕ № 3 (лабораторная работа)

ТЕМА: Равновесное связывание лигандов с биомакромолекулами

Цель: Приобрести практические навыки определения физико-химических характеристик взаимодействия

Вопросы для рассмотрения на занятии:

1. Закон Бугера-Ламберта-Бера, отклонения. Физический смысл молярного коэффициента погашения (экстинции). Оптическая плотность.

2. Характер зависимости концентрации комплекса «белок-лиганд» от концентрации лиганда.

3. Способы линеаризации зависимости «Концентрация лиганда - Эффект». Координаты Лайнуивера-Берка, Скетчарда, Эди-Хофсти.

4. Определение параметров уравнения линейной регрессии с использованием утилит программы MS Excell.

5. Выполнение практической работы по определению параметров связывания бромкрезолового зеленого с альбумином на спектрофотометре СФ-46

Практическая работа:

Реактивы и оборудование: Спектрофотометр СФ-46, буферные растворы рН = 4.4 и рН = 7.4, альбумин 5 мг/мл (на физ.растворе), бромкрезоловый зеленый 8 мг/мл (на буфере).

1. Приготовить необходимое количество (см. задание по группам) раствора БКЗ с концентрацией 0,1 ммоль/л из маточного (8 мг/мл)

2. Приготовить растворы БКЗ заданной молярной концентрации (С1-С6, от 0,01 до 0,1 мкм/л).

3. Приготовить серию контрольных и опытных проб. В опытной пробе к 2 мл точного раствора БКЗ добавляется 100 мкл раствора альбумина. В контрольной пробе, вместо раствора альбумина берется дистиллированная вода.

4. Измерить оптическую плотность растворов при 625 нм. Оптическая плотность опытной пробы меряется относительно соответствующего контроля.

5. Построить график зависимости D от D/[L].

6. Рассчитать константы связывания.

7. Применить функции программы Exell в расчетах характеристик связывания и оценки аналитических ошибок. Добавить на график линию тренда и уравнение прямой с достоверностью уровня аппроксимации.

 

D

 

 

D/[L]

Задание по группам

	БКЗ 0,1 ммоль/л	Буфер рН 4,4		№	Контроль 100 мкл H2O	Опыт 100 мкл альбумина
C1	1 мл	9 мл			По 2мл С1	По 2мл С1
C2	1 мл	4 мл			По 2мл С2	По 2мл С2
C3	2 мл	3 мл			По 2мл С3	По 2мл С3
C4	3 мл	2 мл			По 2мл С4	По 2мл С4
C5	4 мл	1 мл			По 2мл С5	По 2мл С5
C6	5 мл	0 мл			По 2мл С6	По 2мл С6

 

Mr (БКЗ) = _______

К_св = ______

Самостоятельная работа

1. Чем спектрофотометр отличается от фотоэлектроколориметра?

2. Какие кюветы необходимо использовать при работе на длинах волн УФ-диапазона?

3. Дайте определение понятию «хромофор».

4. Спектр поглощения.

 

Литература

· Фрайфелдер Д. Физическая биохимия. – М., 1980

· Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. – М., 2002

 

 

ЗАНЯТИЕ № 4 (лабораторная работа)

ТЕМА: Определение концентрации веществ в многокомпонентной смеси с использованием спектрофотометрии

Цель: Приобрести практические навыки работы на спектрофотометре, измерить характеристики поглощения веществ и определить концентрации веществ в многокомпонентной смеси

Вопросы для рассмотрения на занятии:

1. Общая теория поглощения света молекулами, хромофор. Схема энергетических уровней.

2. Спектр поглощения. Задачи абсорбционной спектроскопии, спектры, используемые в области физической биохимии.

3. Спектрофотометр, схема, ход работы, отличие от ФЭКа.

4. Факторы, влияющие на абсорбционные свойства хромофора. Эффект рН, полярности и ориентации.

5. Спектрофотометрическое титрование белков.

6. Поглощение поляризованного света.

7. Эмпирические правила интерпретации спектров поглощения биологических макромолекул.

8. Параметры, измеряемые в абсорбционной спектрометрии.

9. Идентификация веществ путем спектральных измерений.

10. «Репортерные» группы.

11. Выполнение практической работы по определению концентрации веществ в многокомпонентной смеси.

Правила работы на спектрофотометре СФ-46:

а) Начинать измерения следует при минимальной ширине щели во избежание засвечивания фотоэлементов спектрофотометра.

б) Открывать крышку кюветного отделения можно только при установленной в положение ЗАКР рукоятке переключения шторки. Снимать показания следует при плотно закрытой крышке кюветного отделения.

в) Перемещать кюветодержатель необходимо осторожно, без рывков, чтобы кюветы сохраняли свое положение на протяжении всего периода измерений.

г) Растворы для исследования должны быть прозрачными, без пузырьков воздуха, способствующих увеличению рассеяния света. Нельзя исследовать холодные растворы, так как на стенках кювет могут конденсироваться пары воды (кюветы запотевают). Кюветы нужно заполнять до такого уровня, чтобы измеряющий световой пучок целиком проходил через слой раствора.

д) Кюветы должны быть чистыми, а их внешние стенки - сухими. Нельзя касаться руками оптических стенок кювет. Капли, царапины и грязь на их поверхности рассеивают, отражают и поглощают свет, что приводит к искажению результатов. Кюветы очень хрупкие, поэтому с ними надо обращаться осторожно, не допускать механических повреждений.

Практическая работа:

Реактивы и оборудование: спектрофотометр СФ-46, стеклянные или пластмассовые кюветы с длиной оптического пути 1 см, растворы рибофлавина (0.1 мМ) и эозина (0.1 мМ) в дистилированной воде, растворы гемоглобина, метгемоглобина (10 мг на 1 мл), тирозина, трипсина, триптофана (2 мг на 1 мл) в буферных растворах рН 7.4 и рН 9.18.

1. Ознакомиться с правилами работы (с помощью преподавателя) на спектрофотометре.

2. Снять спектр гемоглобина (метгемоглобина) от 400 до 650 нм с шагом 5 нм.

3. Снять спектр тирозина (трипсина, триптофана) от 220-310 нм с шагом 5 нм.

4. Построить графики зависимости молярного коэффициента экстинции от длины волны для исследуемых веществ.

5. Проанализировать смесь веществ при двух длинах волн. Выполнение задания на карточке (раздается преподавателем).

Задание по группам

	λ 1	λ 2	Концентрация

 

Длина кюветы = _____

Самостоятельная работа

1. Какие параметры определяют для отождествления измеренного спектра поглощения со спектром какого-либо вещества?

Литература

· Фрайфелдер Д. Физическая биохимия. – М., 1980

 

 

ЗАНЯТИЕ № 5 (лабораторная работа)

ТЕМА: Исследование оптической активности биомолекул. Определение концентрации углеводов с использованием поляриметрии

Цель: Приобрести практические навыки определения оптической активности биологических молекул и измерения концентрации оптически активных веществ с использованием полярометрии

Вопросы для рассмотрения на занятии:

1. Метод дисперсии оптического вращения (ДОВ).

2. Метод кругового дихроизма.

3. Оптическая активность молекул, ассиметрия. Взаимодействие оптически активного вещества с поляризованным светом.

4. Связь между спектрами поглощения и кругового дихроизма, кривыми дисперсии и дисперсии оптического вращения.

5. Относительная оценка методов ДОВ и КД, преимущества и недостатки.

6. Изучение конформационных изменений методом КД.

7. Применение ДОВ и КД для изучения структуры белков и полипептидов.

8. Эмпирические правила применяющиеся для изучения структуры белков и полипептидов.

9. Аппаратура для измерения ДОВ и КД, схема, ход работы.

10. Уравнение Друде. Эффект Коттона.

11. Распространение электромагнитной волны, плоскость поляризации.

12. Выполнение практической работы по определению концентрации углеводов с использованием поляриметра.

Практическая работа:

Реактивы и оборудование: Поляриметр, сахароза (5 г на 50 мл), мальтоза (3 г на 50 мл), рамноза (3 г на 50 мл), глюкоза (5 г на 50 мл), галактоза (3,5 г на 50 мл).

1. Ознакомиться с правилами работы с помощью преподавателя на поляриметре.

2. Измерить длину кюветы.

3. Заполнить кювету заданным раствором углевода, измерить угол вращения.

4. Рассчитать по формуле (справочные данные) молярный коэффициент вращения.

5. Сопоставить полученные данные со справочной информацией.

Задание по группам

	Угол вращения	Молярный коэф. вращения	Концентрация
Сахароза
Мальтоза
Рамноза
Глюкоза
Галактоза

 

Длина кюветы = _____

 

Удельное вращение [α]_λ =

 

Самостоятельная работа

1. Что называют плоскостью поляризации?

2. Что называют кривой КД?

Литература

· Фрайфелдер Д. Физическая биохимия. – М., 1980

· Досон Р Элиот Д. Справочник биохимика. – М., 1991