Визначення вмісту хлорофілу

Вміст хлорофілу в листі залежить від умов освітлення і мінерального живлення, віку листя і ряду інших зовнішніх і внутрішніх чинників. При точних визначеннях спочатку виділяють хлорофіл хроматографічним методом або шляхом його омилення. При порівняльних дослідженнях можна визначити вміст хлорофілу в спиртній або ацетоновій витяжці без попереднього розділення пігментів.

Відомо, що хлорофіли мають максимум поглинання в червоній частині спектру, тоді як супутні їм пігменти не поглинають довгохвильове проміння. Тому при роботі на ФЕКі з використанням червоного світлофільтру або на спектрофотометрі можна достатньо точно визначити вміст хлорофілів, не відділяючи їх від каротиноїдів.

Щоб уникнути втрат хлорофілу всі операції необхідно проводити швидко, в затемненому приміщенні, бажано на холоді.

Хід роботи

1.Отримання витяжки хлорофілу

Подрібнити листя ножицями, відкинувши черешки і крупні жилки, і відважити 300-500 мг. Помістити наважку в ступку, додати кварцового піску або товченого скла і трохи СаСОз, підлити 4-5 мл 80% ацетону або спирту і ретельно розтерти. Змазати знизу носик ступки вазеліном і злити витяжку по паличці у воронку з фільтром (змоченим 80% ацетоном) в мірну колбу на 25 мл, не втрачаючи жодної краплі. Відфільтрувати. Підлити в ступку ще небагато ацетону, розтерти, знову відфільтрувати. Повторити цю операцію 2—3 рази, потім перенести розтерту масу на фільтр. Сполоснути ступку 3 рази ацетоном, злити матеріал у воронку, дати постояти декілька хвилин і відфільтрувати. Промити матеріал ацетоном до повного виділення пігментів (розчинник, що стікає з фільтру, повинен стати безбарвним).

Довести ацетоном витяжку до мітки. Закрити мірну колбу пробкою, ретельно перемішати (перевернути 3 рази вверх дном і збовтати) і берегти до визначення в темряві на холоді.

2.Визначення концентрації хлорофілу на ФЕКі

Для цього за 20 хв. до визначення включити ФЕК, встановити гальванометр на нульову відмітку, поставити червоний світлофільтр, відкрити шторки (попереднє освітлення фотоелементів необхідне тому що в перші хвилини після включення ФЕК дає нестійкі показники). Визначити оптичну густину розчину проти чистого розчинника (ацетону), використовуючи кювети з відстанню між гранями 10 мм Для запобігання випаровування розчинника закрити кювети кришками.

Надійні результати виходять при показниках ФЕКу від 0, 1 до 0, 4. Якщо оптична густина більше 0, 5, то витяжку слід розбавити, відмірявши в чистий, сухий посуд визначені об'єми витяжки і ацетону; якщо ж показники ФЕКу виявиться нижче 0, 08, необхідно виконати всю роботу спочатку, взявши більш велику наважку.

Повторити вимірювання і з отриманих результатів узяти середнє арифметичне. Визначити концентрацію витяжки за калібрувальним графіком, який побудований на різних розведеннях реактиву Гьотрі.

Завдання: обчислити процентний вміст хлорофілу в листі. Результати аналізів всіх об'єктів, досліджених групою, записати в таблицю 4.2:

Таблиця 4.2.

Об'єкт	Наважка, мг	Об'єм витяжки, мл	Оптична густина	Кількість хлорофілу за калібрувальним графіком, мг/100 мл	Вміст хлорофілу %

У висновках зіставити вміст хлорофілу в різних об'єктах.

3.Визначення концентрації хлорофілу на СФі

При роботі на спектрофотометрі (кювета 10 мм) можна визначити оптичну густину ацетонової витяжки (Б) при довжині хвилі 652 нм і обчислити вміст суми хлорофілів а і b за формулою:

 

С _a+b = 30D₆₅₂ (мг/л) (4.1.).

 

Більш точно вміст окремих пігментів можна встановити за допомогою трьоххвильового методу, визначаючи оптичну густину витяжки при 665, 649 і 440 нм (максимуми поглинання відповідно хлорофілу а, хлорофілу b і каротиноїдів). Розрахувати концентрацію пігментів за наступними формулами:

С_а = 11, 63D₆₆₅ – 2, 39D₆₄₉ (мг/л) (4.2.)

C_b = 20, 11D₆₄₉ – 5, 18D₆₆₅ (мг/л) (4.3.)

C_карот = 4, 695D₄₄₀ – 0, 268_Ca+b (мг/л) (4.4.).

 

Завдання: визначити співвідношення пігментів в листі різних рослин – хлорофілу а, хлорофілу b і каротиноїдів за допомогою трьоххвильового спектрофотометричного методу.