Теоретические основы. Основываясь на влиянии внешних условий на микроорганизмы, в микробиологической практике разработан ряд приемов

Основываясь на влиянии внешних условий на микроорганизмы, в микробиологической практике разработан ряд приемов, приводящих микроорганизмы к гибели. Одним из таких приемов является стерилизация. Под стерилизацией (обеспложиванием) понимают полное уничтожение микроорганизмов и их спор в питательных средах, посуде, на инструментах и других предметах лабораторного оборудования. Для этого наиболее часто пользуются воздействием высокой температуры.

Стерилизация обжиганием на пламени горелки

Небольшие стеклянные (палочки, шпатель) и металлические предметы (игла, петля, пинцет, скальпель) проводят несколько раз через пламя горелки. Стерилизация достигается обугливанием находящихся на их поверхности микроорганизмов. Обжиганием на пламени пользуются для стерилизации поверхности ватных пробок, горла посуды.

Стерилизация кипячением

Стерилизацию металлических инструментов и резиновых трубок проводят кипячением. Так как споры некоторых бактерий сохраняют жизнеспособность при кипячении в воде в течение нескольких часов, то рекомендуется стерилизацию кипячением проводить в 2%- ном растворе карбоната натрия в течение 10 минут. В этих условиях споры погибают.

Стерилизация сухим жаром

Сухим жаром стерилизуют в основном стеклянную посуду. При этом пробирки, колбы предварительно закрывают ватными пробками. Чтобы избежать заражения простерилизованных предметов из воздуха, их перед стерилизацией заворачивают в оберточную бумагу, а вынимают только перед работой. Пипетки заворачивают полоской бумаги шириной 2, 5-3, 0 см. Предварительно в конец пипетки, который берут в рот, вкладывают ватный тампон. Капиллярный конец пипетки кладут на полоску бумаги под углом 45 градусов и заворачивают по спирали. Чашки Петри заворачивают в бумагу в форме квадрата. Чашку Петри помещают на середину листа, загибают его с двух противоположных сторон кверху, края дважды загибают швом. Два свободных конца загибают вниз. При таком обертывании у чашек легко различить верх и низ. Подготовленную таким образом посуду помещают в сушильный шкаф, в котором нагревают ее при температуре 160-170^оС в течение 2ч. При таком нагревании погибают не только бактерии, но и их споры. Температуру в сушильном шкафу выше 175^оС допускать не следует, так как при этом ватные пробки буреют, а бумажная обертка становится ломкой.

Стерилизация автоклавированием применяется, главным образом, для стерилизации питательных сред. Этот способ основан на прогрева­нии насыщенным паром при давлении выше атмосферного, т. е. при температуре выше 100° С и осуществляется в специальных аппаратах -автоклавах. Совместное действие высокой температуры и пара обеспечивает надежность стерилизации - гибель вегетативных клеток и спор микро­организмов. Автоклавирование проводят при различных режимах, при дополнительном давлении 50, 100, 200 кПа

Автоклавы бывают различной конструкции, но основанные на од­ном принципе. Это металлический двустенный котел, способный вы­держивать высокое давление. Внутренняя часть котла - стерилизационная камера, в которую помещают стерилизуемый материал, окружена водопаровой камерой, имеющей кран для выхода воздуха и пара. При стерилизации в водопаровую камеру наливают воду (лучше дистилли­рованную) до необходимого уровня. Внутрь стерилизационной камеры на специальную подставку помещают стерилизуемый материал. Пред­меты следует размещать не слишком плотно, так как пар должен сво­бодно проходить между ними. Крышка автоклава герметически закры­вается (рис. 1).

 

Рисунок 1-Схема автоклава: 1-стерилизационная камера, 2- кран для выхода воздуха, 3-манометр, 4-предохранительный клапан, 5-водопаровая камера, 6-воронка для заполнения автоклава водой, 7-отверстия для поступления пара в стерилизационную камеру, 8-крышка автоклава, 9-подставка для размещения стерилизуемых материалов

 

Автоклав включается в электрическую сеть. Когда весь воздух бу­дет вытеснен парами воды, пар выпускают еще 15-20 мин. За давлением следят по манометру.

Стерилизация текучим паром. Дробная стерилизация или тиндализация

Питательные среды (молоко, солод, желатин), воду, резиновые трубки и другие предметы, портящиеся от действия сухого жара, подвергают стерилизации текучим паром. Стерилизацию текучим паром производят в кипятильнике Коха или в автоклаве с открытым вентилем. Воду в них доводят до кипения, и образующийся пар обтекает стерилизуемые объекты. Температура стерилизуемых питательных сред достигает 100^оС. Нагревание в течение 30-45 минут приводит к гибели вегетативных клеток бактерий, но споры их не погибают. На следующий день нагревание повторяют. При этом погибают вегетативные клетки, развившиеся из спор. Для обеспечения полной стерильности жидкость оставляют еще на сутки и снова повторяют нагревание. Такую стерилизацию называют дробной или тиндализацией.

Пастеризация

В основе пастеризации лежит нагревание жидкостей до температуры меньше 100^оС. Цель ее – уничтожение неспороносных бактерий в жидкостях, теряющих питательные свойства при кипячении (молоко, пиво, вино и др.). Осуществляется пастеризация нагреванием жидкостей при 60^оС в течение 30 минут или пи 75^оС в течение 15 минут, или при 80^оС в течение 10 минут.

Холодная стерилизация

Органические жидкости, не выносящие нагревания, освобождают от бактерий, пропуская через стерильные мелкие пористые фильтры. Мембранные фильтры готовят из коллодия, ацетата целлюлозы и др. материалов. Они представляют собой диски толщиной около 0, 1 мм, диаметром 35 мм. В зависимости от размеров пор они обозначаются № 1, 2, 3, 4 и 5. (см табл. 1)

 

Таблица 1

 

Мембранные фильтры

 

№ фильтра	Средний диаметр пор, мкм
	0, 35
	0, 5
	0, 7
	0, 9
	1, 2

 

Для стерилизации следует использовать фильтр № 1. Перед употреблением мембранные фильтры стерилизуют кипячением. Фильтры помещают в теплую дистиллированную воду и кипятят 30 минут, меняя ее 2 – 3 раза.

Стерилизация в автоклаве паром под давлением

Наиболее надежный и универсальный метод стерилизации питательных сред и материалов – стерилизация их насыщенным паром под давлением. Производят ее в автоклаве, в котором стерилизуемые объекты нагревают чистым насыщенным паром при давлении выше атмосферного. Когда насыщенный пар встречается с более холодным объектом, он конденсируется, превращаясь в воду. При конденсации выделяется большое количество теплоты, и температура стерилизуемого объекта быстро повышается. Обработку насыщенным паром проводят в герметически закрывающемся толстостенном котле – автоклаве. Автоклавы бывают различной конструкции, но основанные на одном принципе. Это металлический двустенный котел, способный выдерживать высокое давление. Внутренняя часть котла – стерилизационная камера, в которую помещают стерилизуемый материал, окружена водопаровой камерой, имеющей кран для выхода воздуха и пара. При стерилизации в водопаровую камеру наливают воду (лучше дистиллированную) до необходимого уровня. Внутрь стерилизационной камеры на специальную подставку помещают стерилизуемый материал. Предметы следует размещать не слишком плотно, так как пар должен свободно проходить между ними. Крышка автоклава герметически закрывается. Автоклав включается в электрическую сеть. Когда весь воздух будет вытеснен парами воды, пар выпускают еще 15 – 20 минут. За давлением следят по манометру. Большинство питательных сред (мясо – пептонный бульон, мясо – пептонный агар), а также водопроводную воду стерилизуют в автоклаве при давлении 100 кПа в течение 20 – 30 минут; картофельную среду при 150 кПа в течение 30 минут; среды, содержащие сахара и витамины (сусло, соки и т.д.), при 50 кПа в течение 20 – 30 мин; дрожжевой автолизат и среды с желатином при 50 кПа в течение 15 мин. Автоклав используют и для дробной стерилизации текучим паром. В этом случае крышку не завинчивают, чтобы обеспечить свободный выход пару.