Студопедия — Приготовление реактива Эллмана
Студопедия Главная Случайная страница Обратная связь

Разделы: Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

Приготовление реактива Эллмана






1. Для получения 10 мМ раствора реактива Эллмана 37 мг 5, 5'-дитиобис[2-нитробензойной] кислоты растворяют в 10 мл 0, 1 М калий-фосфатного буфера рН 7, 0. Перемешивают до полного растворения.

2. В полученный раствор добавляют 15 мг бикарбоната натрия и снова перемешивают.

 

Определение кинетических параметров, KM и Vmax, реакции гидролиза ацетилтиохолина под действием ацетилхолинэстеразы

1. В пяти пробирках в соответствии с приведенной ниже таблицей готовят разведения ацетилтиохолина (исходная концентрация 10 –3 М):

 

№ пробирки (разведения) Концентрация АТХ, мМ V АТХ , мл V буфер*), мл
       
  0, 5    
  0, 4 0, 8 1, 2
  0, 2 0, 4 1, 6
  0, 1 0, 2 1, 8

*) – 0, 1 М натрий-фосфатный буфер рН 7, 40 (далее – «буфер»)

 

2. В фотометрическую кювету вносят:

0, 5 мл мембран эритроцитов,

0, 2 мл буфера;

0, 5 мл реактива Эллмана.

Смесь тщательно перемешивают.

3. Затем, по секундомеру, в кювету при тщательном перемешивании добавляют 0, 5 мл раствора АТХ из пробирки №1 (см. таблицу).

4. Кювету помещают в спектрофотометр и через 10 секунд после внесения АТХ обнуляют значение оптической плотности при 412 нм.

5. Регистрируют изменение оптической плотности при 412 нм в течение 2 мин с интервалом 20 секунд (9 точек).

6. Для разведений субстрата в пробирках №2, №3, №4 и №5 (см. таблицу) манипуляции повторяют согласно пунктам 2-5.

7. Полученные данные заносят в таблицу.

 

t, секунды Оптическая плотность, А412
Разведение №1 Разведение №2 Разведение №3 Разведение №4 Разведение №5
           
           
           
           
           
           
           
           
           
           

 

8. Результаты измерений отражают графически в виде зависимостей оптической плотности от времени, характеризующих кинетику данной ферментативной реакции при разных концентрациях субстрата (все пять графиков строят на одних координатных осях).

9. Затем строят график зависимости скорости данной ферментативной реакции от концентрации субстрата. Скорость реакции выражают в значениях оптической плотности от концентрации АТХ (то есть для каждого разведения), полученных в один и тот же промежуток времени. Для построения графика используют значения оптической плотности, полученные через 60 секунд от начала реакции. График строят в соответствии с ниже приведенной таблицей:

 

№ разведения Концентрация АТХ, мМ Данные для построения графика по уравнению Михаэлиса-Ментен Данные для построения графика Лайнуивера-Берка
Конечная концентрация АТХ (в кювете), мМ А412 при t=60 c 1/[АТХ]*) 1/А412
           
  0, 5        
  0, 4        
  0, 2        
  0, 1        

*) – [АТХ] – конечная концентрация АТХ.

 

10. Полученную зависимость преобразуют в координатах Лайнуивера-Берка в соответствии с таблицей, и рассчитывают значения KM и V max, характеризующие гидролитическое расщепление АТХ под действием ацетилхолинэстеразы.

 







Дата добавления: 2014-11-10; просмотров: 1347. Нарушение авторских прав; Мы поможем в написании вашей работы!



Важнейшие способы обработки и анализа рядов динамики Не во всех случаях эмпирические данные рядов динамики позволяют определить тенденцию изменения явления во времени...

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ МЕХАНИКА Статика является частью теоретической механики, изучающей условия, при ко­торых тело находится под действием заданной системы сил...

Теория усилителей. Схема Основная масса современных аналоговых и аналого-цифровых электронных устройств выполняется на специализированных микросхемах...

Логические цифровые микросхемы Более сложные элементы цифровой схемотехники (триггеры, мультиплексоры, декодеры и т.д.) не имеют...

Гносеологический оптимизм, скептицизм, агностицизм.разновидности агностицизма Позицию Агностицизм защищает и критический реализм. Один из главных представителей этого направления...

Функциональные обязанности медсестры отделения реанимации · Медсестра отделения реанимации обязана осуществлять лечебно-профилактический и гигиенический уход за пациентами...

Определение трудоемкости работ и затрат машинного времени На основании ведомости объемов работ по объекту и норм времени ГЭСН составляется ведомость подсчёта трудоёмкости, затрат машинного времени, потребности в конструкциях, изделиях и материалах (табл...

Метод архитекторов Этот метод является наиболее часто используемым и может применяться в трех модификациях: способ с двумя точками схода, способ с одной точкой схода, способ вертикальной плоскости и опущенного плана...

Примеры задач для самостоятельного решения. 1.Спрос и предложение на обеды в студенческой столовой описываются уравнениями: QD = 2400 – 100P; QS = 1000 + 250P   1.Спрос и предложение на обеды в студенческой столовой описываются уравнениями: QD = 2400 – 100P; QS = 1000 + 250P...

Дизартрии у детей Выделение клинических форм дизартрии у детей является в большой степени условным, так как у них крайне редко бывают локальные поражения мозга, с которыми связаны четко определенные синдромы двигательных нарушений...

Studopedia.info - Студопедия - 2014-2024 год . (0.008 сек.) русская версия | украинская версия