Студопедия Главная Случайная страница Обратная связь

Разделы: Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

Лабораторная работа 3-2





КМ К-562 метят изотопом 3Н-уридином (1 мкКи/мл) и инкубируют 1 ч при 37 °С. Затем клетки трижды отмывают культуральной средой, содержащей 10% СЭК. Отмытые КМ выдерживают в культуральной среде 2 ч при 37 °С и отмывают еще раз с целью удаления 3Н-уридина, не включившегося в РНК КМ. Готовят рабочую суспензию меченых КМ с таким расчетом, чтобы в 1 мл содержалось 1× 106 КМ и 5 мкг панкреатической РНК-азы.

Цитотоксическую реакцию проводят в круглодонных 96-луночных микропланшетах. В каждую ячейку помещают по 100 мкл рабочей суспензии меченых КМ с РНК-азой и 100 мкл суспензии мононуклеарных клеток (рабочая концентрация - 1х107/мл). Используют различные соотношения КЭ: КМ - 100: 1; 50: 1; 25: 1; 12, 5: 1. Клетки каждого разведения помещают как минимум в 3 лунки. В контрольных пробах меченые КМ инкубируют без мононуклеарных клеток.

Культуры инкубируют 14 ч при 37 °С и с 5% содержанием СО2. После инкубации содержимое лунок переносят на фильтры с помощью собирателя клеток - харвестра. Фильтры высушивают, помещают в сцинтилляционную жидкость, проводят учет реакции с помощью β -счетчика. Показатель функциональной активности естественных киллеров выражают в виде индекса цитотоксичности (ИЦ), который определяют по формуле:

Оценка функциональной активности NK-клеток с использованием проточной цитометрии

В качестве метки для КМ применяют флуоресцентный краситель 5-, 6-карбоксифлуоресцеин диацетатсукцинилмидиловый эфир (КФДЭ), который образует прочную ковалентную связь с внутриклеточными белками и в используемой концентрации не влияет на жизнеспособность клетки.

 

Первоначально нефлуоресцирующий КФДЭ проникает через клеточную мембрану. Карбоксифлуоресцеины связываются с внутриклеточными молекулами, формируя конъюгаты, обеспечивая стойкое флуоресцентное окрашивание клетки. Окрашенные таким образом КМ К-562 смешивают с КЭ и инкубируют в течение нескольких часов. После окончания культивирования клетки окрашивают пропидий йодидом для определения убитых в ходе реакции КМ. По количеству убитых К-562 определяют активность NK-клеток. Анализ проводят на проточном цитофлуориметре и определяют количество КМ, включивших КФДЭ (зеленое свечение), и количество убитых клеток, включивших пропидий йодид (красное свечение).







Дата добавления: 2014-11-10; просмотров: 547. Нарушение авторских прав; Мы поможем в написании вашей работы!




Функция спроса населения на данный товар Функция спроса населения на данный товар: Qd=7-Р. Функция предложения: Qs= -5+2Р,где...


Аальтернативная стоимость. Кривая производственных возможностей В экономике Буридании есть 100 ед. труда с производительностью 4 м ткани или 2 кг мяса...


Вычисление основной дактилоскопической формулы Вычислением основной дактоформулы обычно занимается следователь. Для этого все десять пальцев разбиваются на пять пар...


Расчетные и графические задания Равновесный объем - это объем, определяемый равенством спроса и предложения...

БИОХИМИЯ ТКАНЕЙ ЗУБА В составе зуба выделяют минерализованные и неминерализованные ткани...

Типология суицида. Феномен суицида (самоубийство или попытка самоубийства) чаще всего связывается с представлением о психологическом кризисе личности...

ОСНОВНЫЕ ТИПЫ МОЗГА ПОЗВОНОЧНЫХ Ихтиопсидный тип мозга характерен для низших позвоночных - рыб и амфибий...

Седалищно-прямокишечная ямка Седалищно-прямокишечная (анальная) ямка, fossa ischiorectalis (ischioanalis) – это парное углубление в области промежности, находящееся по бокам от конечного отдела прямой кишки и седалищных бугров, заполненное жировой клетчаткой, сосудами, нервами и...

Основные структурные физиотерапевтические подразделения Физиотерапевтическое подразделение является одним из структурных подразделений лечебно-профилактического учреждения, которое предназначено для оказания физиотерапевтической помощи...

Почему важны муниципальные выборы? Туристическая фирма оставляет за собой право, в случае причин непреодолимого характера, вносить некоторые изменения в программу тура без уменьшения общего объема и качества услуг, в том числе предоставлять замену отеля на равнозначный...

Studopedia.info - Студопедия - 2014-2025 год . (0.013 сек.) русская версия | украинская версия