Амплификация фрагментов ДНК с помощью полимеразной цепной реакцииМетод полимеразной цепной реакции (ПЦР) был разработан Кэри Мюллисом и стал неотъемлемой процедурой, освоенной во всех генно-инженерных лабораториях мира. Использование ПЦР методики позволяет амплифицировать (размножать)ДНК или её фрагмент in vitro увеличивая количество копий в миллионы раз за несколько часов. ПЦР осуществляют в пробирке с помощью специального термостабильного фермента ДНК-полимераза (Tag-полимеразы), набора всех четырех нуклеотидов А, Т, Г и Ц и коротких олигонуклеотидных затравок – праймеров. Праймеры– это короткие, длиной в 20-30 нуклеотидов, одноцепочечные фрагменты ДНК, комплементарные 3’-концевым последовательностям копируемой ДНК-матрицы. Благодаря праймерам ограничивается фрагмент ДНК, который будет скопирован Tag-ДНК-полимеразой, присоединяющейся к 3’-концам праймерови достраивающие их до заданной длины. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) протекает в три стадии. 1. Денатурация. Инкубационную смесь, в которой содержится образец нужной ДНК, нагревают до температуры 90С. При этом, в течении 15 секунд происходит разрушение слабых водородных связей между нитями ДНК, и из одной двухцепочечной молекулы образуется две одноцепочечные. 2. Гибридизация праймеров. Температуру снижают до 50С. При этом происходит гибридизация цепей ДНК с праймерами. Эта стадия обычно протекает 30 секунд. 3. Полимеризация. Инкубационную смесь нагревают до температуры 70С. При этой температуре Tag-полимераза удлиняет оба праймера с их 3’-концов. Праймеры дорастают до размеров матрицы. Этот процесс протекает в течении 90 секунд. В результате количество ДНК удваивается. Фермент Tag-полимераза была выделена из термофильных бактерий Thermus aquaticus, и отличается устойчивостью к высокой температуре. При температуре 70 С гибрид праймер-ДНК не денатурирует, а Tag-полимераза способна работать с большой скоростью. За 20 циклов амплификации количество копий ДНК достигает величины 106. В последние годы удалось создать специальный прибор–амплификатор, с помощью которого все три стадии размножения ДНК производятся автоматически, что превратило процесс ПЦР-амплификации конкретной последовательности ДНК в простую задачу. За разработку метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) в 1993г. Кэри Мюллис (K.Mullis) был удостоен звания лауреата Нобелевской премии.ПЦР технологии позволили ученым без огромных временных и материальных затрат получать точные данные по структуре генов и фрагментов ДНК при наличии самого минимального количества биологического материала. Одним из важнейших применений ПЦР стала диагностика наследственных заболеваний человека, особенно на пренатальных стадиях развития при наличии малого количества ДНК из фетальных клеток. Вторым, не менее важным применением ПЦР технологий стала дактилоскопия и идентификация индивидуумов, используя материал ДНК, полученный из нескольких сперматозоидов, или одного волоса и, внекоторых случаях, даже из одного бластомера, выделенного из зародыша (пре-эмбриона) на стадии восьми зародышевых клеток.
|
