Студопедия Главная Случайная страница Обратная связь

Разделы: Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

Получение нейронов из ЭСК





 

Уже в начале 90-х годов в печати появились первые протоколы наработки дифференцированных нейронов из ЭСК тератокарциномы (Yao M.,Bain G., GottliebD.L.,1995). Сперва незрелые клетки тератокарциномы размножали с помощью ростовых факторов в простой питательной среде с добавками. Затем клетки переводили в среду без ростовых факторов, в которую добавляли ретиноевую кислоту и В27 Neurobasal supplement. В новой среде селективно выживали только постмитотические нейробласты, а незрелые стволовые/прогениторные популяции погибали. В первых работах эффективность образования нейронов in vitro оставалась ниже 10 %. Однако эффективность лабораторного нейрогенеза можно значительно улучшить, если на первом этапе улучшить образование НСК из ЭСК. Сперва необходимо увеличить выход нестин+ клеток в культуре. Затем изолированную популяцию НСК размножали в селективной среде. Выход нейронов из высокоочишенной фракции НСК довели до 60-80%. В конце 90-х годов фирма BioLayton (Калифорния) оказалась первым частным собственником технологической линии с целью крупномасштабного выращивания нейронов человека по всем стандартам GМP. Из стандартного сырья стали готовить биотрансплантаты для лечения пациентов. Первоначально фирма купила университетский патент Пенсильванского университета (авторы - Virginia Lee, John Troyanovsky, No5792900), заявленный на способ изготовления нейротрансплантата в виде однородной популяции нейронов, полученных из плюрипотентных незрелых клеток эмбриональной тератокарциномы NT2N. Образование нейронов индуцировали добавлением сыворотки и ретиноевой кислоты под контролем следующих маркеров: нестин, NF-1, MAP-2C, alpha-internexin.Через 5-7 дней островки прикрепившихся незрелых клеток начинали синтезировать N-кадхерин и NCAM. Еще через три дня после добавления индукционной среды, состав которой запатентован, клетки образовали нейрофиламенты, увеличивали фосфорилирование компонентов цитоскелета и сигнальных белков. Еще через 10-13 дней культивирования 90-98% клеток приобретали фенотип нейробластов с характерными отростками. Примерно 4-5 нед уходило на созревание нейронов из ЭСК. Нейроны возникали не только из одиночных прикрепленных клеток, но и агрегатов ЭСК. Синхронно с появлением маркеров диффренцировки из клеток исчезал нестин. Более зрелые нейроны экспрессировали белок tau и MAP-2b. Согласно GLP-протоколу, до 95% клеток в культуре превращались в типичные нейроны с характерными отростками, электровозбудимой мембраной и секрецией медиаторов. Остальные незрелые примесные клетки высортировывали на поточном сортировщике клеток. Лабораторно полученные нейроны не ревертировали спонтанно к фенотипу тератокарциномы или незрелых клеток, не давали опухолей при введении в ткани животным. Лабораторно полученные нейроны фирмы BioLayton хорошо выживали после трансплантации в мозге животных-реципиентов. Часть клеток пролиферировала и встраивалась в локальные нейрональные сети (детали см. www.biolayton.com). На языке профиля мРНК рестрикционное созревание тератокарциномы NT-2 делилось на три этапа. (Przyborski S.A., Morton I.E., Wood A. et al., 2000). В первую фазу увеличивалось число нестин+ клеток, что совпадало с увеличением Notch-1 мРНК. Во вторую фазу роста мРНК NeuroD и снижения мРНК нестина происходило накопление пула прогениторных клеток. Фазу постмитотических зрелых нейронов верифицировали по накоплениею мРНК синаптофизина и энолазы и одновременному исчезновению мРНК NeuroD.

Пути дифференцировки нейробластов из ЭСК тератокарциномы прослеживали с помощью профиля экспрессии других генов. В случае дорзальных (чувствительных) нейронов первой появлялась мРНК гена Рах-7 после добавления ретиноевой кислоты. В случае вентральных нейронов первой детектировалась мРНК гена Рах-6. Появление клеток нервного гребня в культуре маркировали появлением мРНК генов Рах-7 и Erb3. Дальнейшее созревание сомато-мотонейронов маркировали экспрессией Islet-1, Islet-2, Lim-3, HB-9. Краниальные мотонейроны экспрессировали мРНК Islet-1, Islet-2, Phox-2b. Интернейроны экспрессировали мРНК Lim-1, Lim-2, Eng-1 (Renoncourt Y., Carroll P., Filippi P. et al., 1998).

Ключевым моментом созревания ДОПА-нейронов из ЭСК линии NT2 была экспрессия гена тирозингидроксилазы (ТГ). В культуре максимальное количество ТГ+ клеток удавалось получить с помощью трех индукторов: FGF-1, стимулятора внутриклеточного уровня цАМФ (форсколина) и активатора протеинкиназы С (форболового эфира –форбол-12-миристоил-13-ацетата). Эта «триада» вызывала появление 10-20% ТГ+ нейробластов. Однако путем двухнедельной инкубации в специальной среде для дифференцировки долю ТГ+ клеток удалось поднять до 75% (Iacovitti L., Stull N.D., Jin H.,2001). In situ, т.е. в ходе эмбриогенеза ТГ+ нейробласты появлялись под влиянием других сигналов (SHH и FGF8) (Stull N.D., Iakovitti L., 2001). Эти данные показали, что лабораторные нейроны с выбранным профилем медиаторов реально получать «неприродным» альтернативным путем, в обход путей и сигналов эмбриогенеза мозга.

Другая стратегия наработки нейронов из линии ЭСК человека намечена сотрудниками фирмы Герон (Carpenter M.K., Inokuma M.S., Denham J. et al.,2001). В суспензионной культуре ЭСК над фидером нарабатывают значительные массы эмбриоидных телец. Далее начальную дифференцировку запускают прикреплением агрегатов к подложке в среде с набором митогенов. Прикрепленные массы начинают расти незрелой тканью, в которой экспрессируются ранние гены нервной трубки. В ткани формируются клон-инициирующие клетки. Новообразованные клоны маркировались нестином, виментином, GFAP, PC-NCAM. Долю клонов НСК можно значительно увеличить путем подбора митогенов в селективной среде. При пересадке выращенной незрелой ткани, напоминающей нервную трубку, в мозг новорожденным мышам наблюдали интенсивную миграцию прогениторных клеток в разные отделы мозга с последующей дифференцировкой внейроны, глию и олигодендроциты (Carpenter M., Inokuma M.S., Denman J., 2001)

Ретиноевая кислота оказалась первым незаменимым индуктором нейрогенинов или Neuro D на пути дифференцировки ЭСК в нейроны. Однако нет четких однозначных прописей получения холинэргических, ГАМК- или серотонинэргических нейронов на втором этапе дозревания бластных форм. Комбинации ростовых факторов, нейротрофинов и других индукторов в дучшем случае заканчивались смешанной дифференцировкой нейронов in vitro (Takahashi J., Palmer T.D., Gage F.H., 1999). Существенно также, что нейрогенез in vitro, запускаемый ретиноевой кислотой, формировал нейроны из агрегатов, прикрепленных к поверхности крупных распластанных клеток (по фенотипу –это клетки первичной эктодермы, либо нейромезенхимы)(Bain G., Kitchens D, Uao M. et al., 1995).

 

 







Дата добавления: 2015-10-19; просмотров: 432. Нарушение авторских прав; Мы поможем в написании вашей работы!




Важнейшие способы обработки и анализа рядов динамики Не во всех случаях эмпирические данные рядов динамики позволяют определить тенденцию изменения явления во времени...


ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ МЕХАНИКА Статика является частью теоретической механики, изучающей условия, при ко­торых тело находится под действием заданной системы сил...


Теория усилителей. Схема Основная масса современных аналоговых и аналого-цифровых электронных устройств выполняется на специализированных микросхемах...


Логические цифровые микросхемы Более сложные элементы цифровой схемотехники (триггеры, мультиплексоры, декодеры и т.д.) не имеют...

СПИД: морально-этические проблемы Среди тысяч заболеваний совершенно особое, даже исключительное, место занимает ВИЧ-инфекция...

Понятие массовых мероприятий, их виды Под массовыми мероприятиями следует понимать совокупность действий или явлений социальной жизни с участием большого количества граждан...

Тактика действий нарядов полиции по предупреждению и пресечению правонарушений при проведении массовых мероприятий К особенностям проведения массовых мероприятий и факторам, влияющим на охрану общественного порядка и обеспечение общественной безопасности, можно отнести значительное количество субъектов, принимающих участие в их подготовке и проведении...

Схема рефлекторной дуги условного слюноотделительного рефлекса При неоднократном сочетании действия предупреждающего сигнала и безусловного пищевого раздражителя формируются...

Уравнение волны. Уравнение плоской гармонической волны. Волновое уравнение. Уравнение сферической волны Уравнением упругой волны называют функцию , которая определяет смещение любой частицы среды с координатами относительно своего положения равновесия в произвольный момент времени t...

Медицинская документация родильного дома Учетные формы родильного дома № 111/у Индивидуальная карта беременной и родильницы № 113/у Обменная карта родильного дома...

Studopedia.info - Студопедия - 2014-2025 год . (0.011 сек.) русская версия | украинская версия