II. Блок материалов для обучения.

Основные свойства гемоглобина.

 

Определение концентрации гемоглобина в крови – одно из самых распространенных лабораторных исследований. Гемоглобин обеспечивает энергетические процессы в организме, благодаря переносу им кислорода из легких в ткани.

Современные представления о структуре гемоглобина дают возможность понять причины возникновения различных гемоглобинопатий.

Гемоглобин относится к группе окрашенных белков – хромопротеидов, но поскольку он сам состоит из гема и белка глобина, его следует отнести к более узкой группе белков гемопротеидов. Кроме гемоглобина к гемопротеидам относятся: белок мышечной ткани миоглобин и гемсодержащие ферменты – каталаза, пероксидаза и цитохромы, основное количество которых находится в клетках печени.

Гем представляет собой комплекс железа с протопорфирином. Железо в геме может быть 2-х валентным (Fe²⁺ - ферроформа) и 3-х валентным (Fe³⁺ - ферриформа).

Основной функцией гемоглобина является транспорт кислорода, обусловленный способностью гемоглобина обратимо связывать молекулярный кислород – О₂. Один гем может переносить одну молекулу кислорода. Помимо кислороды гемоглобин способен переносить протоны Н⁺ и углекислый газ СО₂, связывать угарный газ СО и цианиды CN^-.

Каждая молекула гемоглобина состоит из 4-х субъединиц, включающих гем и глобин; следовательно, одна молекула гемоглобина переносит 4 молекулы кислорода. Гемы во всех субъединицах одинаковы, однако наличие 4-х гемов в одной молекуле оказывает влияние на связывание кислорода: присоединение О₂ к одному из гемов облегчает его связывание с другими гемами (кооперативный эффект). Присоединение кислорода меняет конформацию (пространственную структуру) молекулы и некоторые ее свойства, а визуально оценивается как изменение цвета крови. Интенсивность связывания кислорода зависит от его парциального давления в крови и концентрации других регуляторов, таких как СО₂, Н⁺, 2,3-дифосфоглицерата (2,3-ДФГ). Избыток углекислоты и протонов повышает диссоциацию оксигемоглобина на гемоглобин и кислород, а их недостаток способствует образованию оксигемоглобина. 2,3-ДФГ снижает сродство гемоглобина к кислороду.

Молекулу гемоглобина формируют несколько видов полипептидных цепей (белков). Полипептидные цепи гемоглобина, как и других белковых молекул, состоят из аминокислотных остатков и отличаются друг от друга составом и количеством аминокислот. Пространственная структура полипептидных цепей обеспечивает расположение гема, наиболее удобное для связывания им кислорода.

Полипептидные цепи гемоглобина у здоровых людей представляют собой: α-цепи, состоящие из 141 аминокислот, β-цепи, δ-цепи, γ-цепи, содержащие 146 аминокислот.

В некоторых случаях появляются другие цепи, которые формируют так называемые минорные гемоглобины.

В каждой молекуле гемоглобина, состоящей из 4-х субъединиц, 2 субъединицы образованы комплексом гема с α-цепями, а 2 другие – комплексом гема с другими одинаковыми белковыми цепями, поэтому гемоглобин (Hb) здорового человека не однороден, а представляет собой смесь, состоящую из различных видов гемоглобина.

 

Основные виды гемоглобина.

1. А₁ – основной гемоглобин человека, гемы которого связаны с двумя α- и двумя β-цепями; имеет белковую формулу – α₂β₂, на его долю приходится 96-98 % от общего количества гемоглобина;

2. А₂ – составляет 2-3,5 %;

3. HbF – фетальный гемоглобин, имеет белковую формулу α₂γ₂; у взрослых составляет 0,2-2 %. У новорожденного HbF составляет 60-80 % всего гемоглобина, через 6-8 месяцев его количество уменьшается до уровня взрослого человека.

 

Кроме указанных, у человека могут присутствовать так называемые минорные гемоглобины, отличающиеся аминокислотным составом белковых цепей. Аномалия гемоглобина, связанная с изменением в белковых цепях, называется гемоглобинопатией или гемоглобинозом. Изменения в полипептидных цепях приводят к изменению растворимости Hb, сродства гемоглобина к кислороду и др. Гемоглобинопатия может быть связана с заменой одного аминокислотного остатка на другой (например, серповидноклеточная анемия) или с нарушением синтеза цепей гемоглобина (например, группа талассемий).

Талассемии относятся к количественным гемоглобинопатиям. Вид и, соответственно, название заболевания определяется той полипептидной цепью, синтез которой нарушен: при α-талассемии нарушен синтез α-цепей, при β-талассемии – β-цепей и т.д. При всех видах талассемий повышается содержание малых фракций Hb, нарушается формирование эритроидных клеток и насыщение эритроцитов гемоглобином, а при всех гемоглобинопатиях снижается транспорт гемоглобином кислорода.

Различные виды гемоглобина разделяют с помощью электрофореза.

Гемоглобин, как и другие белки, неферментативно образует с глюкозой гликозидные связи и превращается в гликозилированный гемоглобин, уровень которого зависит от среднего уровня глюкозы в крови. У здорового человека гликозилированный гемоглобин составляет 2-5 %, а у больного сахарным диабетом – до 20 %. Гликозилированный гемоглобин, как и другие аналогичные белки, функционально неполноценен.

Все виды гемоглобина, присоединяя те или иные молекулы или ионы, образуют несколько форм, которые присутствуют или могут присутствовать в крови.

 

Формы гемоглобина.

1. HbOz (Fe²⁺) – окисленный гемоглобин – основная форма гемоглобина в артериальной крови (96-98 %);

2. HbH (Fe²⁺) – восстановленный гемоглобин – содержится преимущественно в венозной крови;

3. HbСО (Fe²⁺) – карбоксигемоглобин – у здорового человека содержится 0,25-2 %. HbСО образуется путем присоединения к гему окиси углерода (СО – угарного газа), небольшое количество которого постоянно присутствует в клетке. Уровень HbСО зависит от экологических факторов, вредных привычек, характера работы. Так, у курильщиков он повышается до 6,6 %, а у таксистов – до 20 %. Карбоксигемоглобин не способен к транспорту кислорода.

4. Met Hb (Hi, Fe³⁺) – метгемоглобин или гемиглобин – у здорового человека содержится 0,2-2 %. Наличие фермента НАДФН-метгемоглобин-редуктазы (диафоразы) в присутствии аскорбиновой кислоты обеспечивает восстановление железа в метгемоглобине. В ряде случаев наблюдается повышение содержания метгемоглобина. Концентрация Met Hb 10-20 г/л вызывает появление цианоза. Повышение содержания Met Hb в крови называется метгемоглобинемией. Различают первичные (врожденные) и вторичные (приобретенные) метгемоглобинемии:

1) Первичные метгемоглобинемии связаны с недостаточностью диафоразы, наличием аномальных гемоглобинов;

2) Вторичные метгемоглобинемии развиваются при сердечно-сосу-дистых заболеваниях, апластической и гемолитической анемиях, отравлениях фенолами, нитросоединениями, анилином, нитратами, нитритами, фенацетином, сульфонамидами, бромидами и др.

5. Met HbNO₂ – нитрометгемоглобин – образуется при взаимодействии с нитритами и не восстанавливается до Hb в физиологических условиях; срок жизни его молекулы определяется сроком жизни эритроцита – 90-120 дней. Особую опасность нитритсодержащая вода представляет для новорожденных.

6. Свободный гемоглобин – образуется в результате естественного гемолиза эритроцитов, сопровождающегося разрушением молекулы гемоглобина: отщеплением белка, связыванием железа, раскрытием порфиринового кольца с последующим образованием желчных пигментов; часть гемоглобина, не подвергшаяся этим изменениям поступает в кровь – свободный гемоглобин. Его концентрация колеблется в пределах 10-40 мг/л; в плазме крови транспортируется в соединении с присутствующим в крови специальным белком – гаптоглобином, что способствует сохранению железа в организме.

Диагностическое значение определения гемоглобина.

Содержание гемоглобина зависит от возраста, пола и физиологического состояния. У новорожденных уровень гемоглобина составляет 170-195 г/л, у мужчин 130-150 г/л, у женщин 120-140 г/л.

Снижение гемоглобина наблюдается:

- в первый триместр беременности содержание гемоглобина из-за физиологического разбавления крови;

- у людей старше 65 лет нижние пределы Hb несколько снижены;

- анемиях различного происхождения (железодефицитной, апластической, гемолитической и др.) и разбавлении крови.

Повышение концентрации гемоглобина наблюдается при:

- миело-пролиферативных заболеваниях (например эритремии);

- пребывании на больших высотах;

- хронических гипоксиях;

- гемоконцентрации (дегидратация, ожоги, рвота, кишечная непроходимость); гемоконцентрация также сопровождается повышением значений гематокрита, общего белка, альбумина и некоторых других показателей.

 

Методы определения гемоглобина.

В настоящее время используют две основные группы методов определения гемоглобина:

1. Гемоглобинцианидные методы – основаны на превращении всех форм гемоглобина в циангемоглобин. Для данных методов существуют стандарты с длительным сроком хранения и контрольные материалы – нормальный и патологический. Включение контрольного материла в каждую серию позволяет повсеместно осуществлять внутрилабораторный контроль качества. Данными методами определяются все виды гемоглобина, кроме сульфогемоглобина.

2. Гемолитические методы – основаны на превращении всех форм гемоглобина в окисленный HbO₂. Данные методы чаще используются в гематологических анализаторах. Для них нет пока стабильных стандартов, и калибровка проводится по гемоглобинцианидные методу. карбоксигемоглобин указанным методом не определяется.

Возможные ошибки при определении гемоглобина.

 

1. Некачественные реактивы.

2. Неточное взятие крови (не до метки, с пузырьками воздуха, не снята кровь с кончика капилляра).

3. Не выверена работа ФЭКа.

4. Испорченный стандартный раствор.

5. Использование старого или от другого ФЭКа калибровочного графика.

6. Плохой прокол пальца (сильное надавливание на палец.

Методические указания к практическому занятию.

 

1. При подготовке рабочего места к работе предусмотреть все необходимое и не загромождать стол лишними реактивами и оборудованием.

2. Работать парами: один – пациент, другой – лаборант.

3. Руки пациента должны быть теплыми, чистыми; на руках лаборанта должны быть чистые резиновые перчатки.

4. Прежде чем проколоть палец, следует приготовить пробирку с реактивами.

5. Допускается предварительная работа с капиллярами с цитратной кровью или ее имитацией (тренаж).

6. Обратить внимание на возможные ошибки при определении Hb.

7. Правильно проколоть палец и взять кровь для определения Hb на ФЭКе.

8. Произвести определение Hb.

9. Записать в тетрадь алгоритм методики и полученные результаты.

10. Оформить в тетради таблицу гематологических показателей в норме (приложение №2).

11. Оценить полученные результаты.

12. При уборке рабочего места, обработке капилляров и перчаток соблюдать правила техники безопасности при работе с заведомо инфицированным материалом и электроприборами.