Фотоэлектроколориметр.

Фотоэлектроколориметр (ФЭК) вошел в лабораторную практику настолько широко, что большая часть анализов заканчивается при помощи этого прибора. Принцип действия прибора базируется на основном законе колориметрии, который характеризуется прямолинейной зависимостью между концентрацией окрашенного раствора и его оптической плотностью. Метод измерения относится к объективным, независимым от глаза человека. Индивидуальные ошибки сведены к минимуму. Наиболее распространенными фотоколориметрами в нашей стране являются ФЭК-56 (ФЭК-56М). В них имеются два вакуумных фотоэлемента, токи которых направлены навстречу друг другу по дифференциальной схеме. При равенстве интенсивности левого и правого световых потоков стрелка микроамперметра устанавливается на нуле.

Ранее применявшийся нулевой прибор (индикаторная лампа) себя не оправдал и был заменен стрелочными микроамперметрами. Левый и правый барабан ФЭКа независимы, и каждый из них управляет своей диафрагмой. Порядок работы на ФЭК-56. При первом способе устанавливают электрический нуль при закрытой шторке (световые потоки перекрыты), при этом стрелку микроамперметра устанавливают на нуле. В левый кюветодержатель помещают кювету с нулевым раствором (или контрольным раствором), в правый — кювету с опытным (анализируемым) раствором. Правый барабан устанавливают на нуль оптической шкалы (100 по пропусканию). Вращением левого барабана добиваются установки стрелки микроамперметра на нуль. Затем в правый кюветодержатель вводят кювету с нулевым раствором. Интенсивность правого светового потока возрастает и стрелка микроамперметра отклоняется. Вращением правого барабана уменьшают интенсивность светового потока, пока оба потока не сравняются (стрелка на нуле). Отсчет производят по правому барабану. Как можно заметить, при описанном способе измерения для каждого замера опытной пробы необходимо заново уравнивать световые потоки по нулевому раствору. При большом числе однотипных анализов это замедляет работу. На практике оправдал себя другой порядок измерения, ускоряющий работу примерно в 2 раза. При этом способе уравнивание светового потока с контролем производится один раз на серию из 10—15 определений, после чего снова проверяют контроль и продолжают измерения. Второй способ измерения состоит в следующем. После прогрева ФЭКа в правый и левый пучок света помещают кюветы с контрольным раствором. Индекс правого барабана ставят на нуль экстинкции (100% по пропусканию). Вращением левого барабана стрелка прибора устанавливается на нулевое деление. Затем в левый пучок света вместо кюветы с контролем вводят такую же кювету с опытной пробой. Стрелка прибора отклоняется от нуля. Вращением правого барабана (от себя) стрелку микроамперметра устанавливают на нуль (при неизменном положении левого барабана). Отсчет ведут по правому барабану. В дальнейшем опытную пробу в левом кюветодержателе меняют на следующую и снова уравнивают фототок вращением правого барабана. Снимают отсчет и т. д. (левый барабан остается неподвижным). Для получения правильных результатов при фотоколориметрии большое значение имеет чистота кювет. Переставляя кюветы, их следует брать пальцами только за боковые грани, через которые не проходит световой поток. Для исследования биологических веществ применяются специально очищенные реактивы и вода. Между тем при проведении контрольного опыта, когда проделываются все операции с реактивами (только без биологического материала), обычно обнаруживается окраска, определяемая как искомое вещество (но в меньшем количестве). Эту поправку на контрольную пробу нужно вычесть из результата анализа. В этом

и заключается смысл понятия «против контроля». Вычитание контроля может быть выполнено двумя способами: а) арифметическим вычитанием экстинкции контроля (или его вычисленного значения). В ФЭКе в оба кюветодержателя ставят кюветы с чистой водой и уравнивают фототоки. Затем заменяют воду контрольной пробой. Измеряют экстинкцию контроля. Так же измеряется опытная проба. Полученная экстинкция контроля вычитается из экстинкции опыта (измерения проводятся на фоне воды); б) автоматическим вычитанием. В оба световых потока ставят кюветы с контрольной пробой, и после уравнивания фототоков в измерительной стороне заменяют контрольную пробу на опытную. В этом случае измерение опытной пробы происходит на фоне контроля, который автоматически вычитается в процессе измерения. Величина контроля остается неизвестной. Основной закон фотометрии предполагает, что в определенных условиях график зависимости между концентрацией окрашенного раствора и его экстинкцией (оптической плотностью) выражается прямой линией. На практике, однако, наблюдаются отклонения, вызванные деформацией молекул, недостаточной монохроматичностью света, изменением степени диссоциации ионов и другими причинами. Чаще отклонения бывают с уменьшением пропорциональности, когда равномерное увеличение концентрации вещества сопровождается все меньшим приростом экстинкции, отсюда и название «калибровочная кривая». В зависимости от свойств конкретного вещества, стабильности его окрашенного раствора, воспроизводимости данных применяют тот или иной способ калибровки и дальнейшего его определения. Обычно это указывается в описании метода. Если в выбранном диапазоне концентраций сохраняется прямая пропорциональность с экстинкцией при хорошей воспроизводимости, то в этом случае можно вести расчет результатов анализа как по калибровочному графику, так и с помощью вычисленного коэффициента. Если график аналогичен линии 2, то расчет можно вести только по калибровочному графику, поскольку нет постоянного коэффициента на всем протяжении графика. Основным требованием к такому графику является хорошая воспроизводимость и стабильность при его повторном построении. Во всех случаях работы с калибровочным графиком его надо периодически проверять. Периодичность проверки устанавливается опытным путем. В среднем это можно делать раз в 3 мес. или реже. Нередко на интенсивность окраски исследуемого вещества влияет качество одного из применяемых реактивов. Следовательно, при замене этого реактива следует проверить калибровочный график. То же нужно делать при замене осветительной лампы фотоколориметра или после его ремонта. Проверку не обязательно проводить в полном объеме. Достаточно бывает проверить 2 — 3 точки. При совпадении найденных результатов с прежними, график остается в силе. Так же поступают при работе с коэффициентом. Существуют вещества, чрезвычайно чувствительные к малейшим отклонениям в процессе проведения анализа (например, к условиям кипячения и др.). Если взять две одинаковые пробы и обработать их отдельно, то можно получить неодинаковую окраску (экстинкцию). В таких случаях опытная и стандартная

пробы должны обрабатываться вместе (одновременно), чтобы условия проведения реакции были одинаковыми. Расчет ведут по отношению к стандарту. При этом результат тем точнее, чем ближе концентрации опытных и стандартных проб.