Классы иммуноглобулинов

IgM - с остоит из пяти мономеров, каждый из которых включает две тяжелые μ-цепи и две легкие цепи (каппа или лямбда). Сывороточная концентрация IgM составляет 0,5-2 мг/мл (~5 % от общего количества сывороточных иммуноглобулинов). Мономеры объединены в области Fc-участков в единый пентамер дисульфидными мостиками и соединительной J-цепью (джей). В состав μ-цепи входят один вариабельный и 4 константных домена (Сμ1-Сμ4). Fab-участки молекул IgM обладают гибкостью за счет остатков пролина Сμ2-домена, что придает подвижность активным центрам антител и позволяет им эффективно взаимодействовать с антигенами. Молекула IgM имеет 10 активных центров (валентность равна 10). IgM обладает выраженной антибактериальной активностью, способностью связывать комплемент, не проникает через плацентарный барьер. Первым синтезируется в ответ на антигенную стимуляцию организма. Наиболее ранние антитела относятся к иммуноглобулинам класса М, что нередко используется в диагностике инфекционных заболеваний. Они же первыми появляются в процессе онтогенеза и филогенеза. На мембране В-лимфоцитов присутствует мономерная форма IgM, выполняющая функцию основной составляющей В-клеточного рецептора.

Таким образом, IgM является «первым» иммуноглобулином, т.к. эволюционно он впервые появляется у представителей класса Круглоротых, с него начинается синтез иммуноглобулинов у новорожденных, он первый образуется при иммунном ответе.

IgG является основным иммуноглобулином, т.к. 80% антител крови относится именно к этому классу. Содержится в сыворотке крови в наибольшей концентрации в сравнении с другими классами иммуноглобулинов (до 80% от общего количества сывороточных иммуноглобулинов). Состоит из двух тяжелых (γ) и двух легких цепей (κ или γ). В состав тяжелой цепи входит один вариабельный и три константных домена. Между первым и вторым константными доменами находится шарнирный участок, содержащий остатки пролина и цистеина, определяющие его гибкость. Содержится в сыворотке крови в наибольшей концентрации в сравнении с другими классами иммуноглобулинов (до 80% от общего количества сывороточных иммуноглобулинов). Биологическая роль IgG разнообразна. Антитела класса IgG обладают выраженной антибактериальной, антивирусной активностью, в определенных условиях проявляют противоопухолевое действие. Взаимодействуют с белками системы комплемента. Проникают через плацентарный барьер. Это означает, что материнские антитела класса IgG обладают защитной функцией в отношении организма эмбриона и новорожденного ребенка.

IgA мономер, а также существует также димерная форма IgA. Характерен для секретов организма (слюна, слезы, пот, молозиво, пищеварительный сок, выделения слизистых поверхностей). В сыворотке крови его содержание незначительно и составляет 10-15% от общего количества сывороточных иммуноглобулинов. Тяжелая α-цепь построена из вариабельного домена, трех константных доменов и шарнирного участка. У человека известны два подкласса — IgAl и IgA2. Сывороточный IgA обычно представлен мономером. IgA, секретируемый на поверхность слизистых оболочек, — это димер, образованный двумя мономерами и соединительной J-цепью (джей-цепь). Тяжелые цепи и J-цепь скреплены дисульфидными связями.

Димерный IgA секретируется плазматическими клетками под эпителиальными клетками слизистых оболочек. Затем взаимодействует со специфическим полииммуноглобулиновым рецептором на базальной стороне эпителиальных клеток слизистой оболочки, и образовавшийся комплекс подвергается эндоцитозу с последующей транспортировкой к поверхности клетки, обращенной в просвет органа. Когда комплекс рецептора и IgA достигает мембраны, рецептор подвергается протеолизу, и часть рецептора вместе с димерным IgA выходит на поверхность слизистой в результате экзоцитоза. В целом процесс называется трансцитозом.

Димерный IgA, секретируемый вместе с фрагментом полииммуноглобулиновым рецептором, называется секреторным компонентом. Комплекс димера и секреторного компонента называется секреторным IgA. Именно в такой форме IgA присутствует на слизистых поверхностях и в секретах молочных, потовых, слюнных, слезных желез. Здесь он связывает инфекционные агенты, предотвращая их проникновение с внешних поверхностей в ткани организма.

IgE мономер, включает две ε-цепи и две легкие цепи. ε-цепь содержит один вариабельный и четыре константных домена. В сыворотке крови присутствует в очень небольших концентрациях.Более 90% синтезируемого плазматическими клетками IgE секретируется в слизистый экзосекрет желудочно-кишечного тракта. Биологическая функция заключается в защите от внеклеточных паразитов, хотя она полностью не выяснена, и резкое увеличение количества IgE является патогенетическим признаком при аллергических реакциях. Принимает участие в развитии аллергических реакций. Fc-участком он связывается с Fc-рецептором на поверхности тучных клеток и базофилов. Затем активным центром IgE взаимодействует с аллергеном, что приводит к сшиванию молекул Fc-рецептора на поверхности клетки. После связывания аллергена на поверхности тучных клеток и базофилов с последующей сшивкой Fc-рецепторов клетки получают сигнал к секреции вазоактивных аминов, что приводит к развитию IgE-зависимой аллергической реакции.

IgD мономер: тяжелая цепь IgD построена из одного вариабельного и трех константных доменов. Содержится в сыворотке в исчезающих количествах. Функция сывороточного IgD неизвестна. На поверхности В-лимфоцитов присутствует мембранная форма IgD, входящая в состав В-клеточного рецептора.Активные центры антител, продуцируемых разными клонами плазматических клеток, различаются. Они построены из варьирующих по своему строению участков V-доменов легкой и тяжелой цепей. Такие участки называются гипервариабельными регионами.

Иммунный ответ на каждый отдельный антиген включает продукцию множества молекул антител, синтезируемых разными плазматическими клетками и имеющих разное строение активного центра и изотип. Вследствие различий в строении активных центров образующиеся антитела имеют разную специфичность и разный аффинитет. Один клон плазматических клеток, являющихся потомством В-лимфоцитов, продуцирует антитела одной специфичности. То есть работает закономерность один клон — один тип антител. Специфичность — направленность против конкретного эпитопа какого-либо антигена.

Аффинитет (аффинность) — прочность связи одного антигенсвязывающего центра с индивидуальным эпитопом антигена. Обусловлен степенью пространственного соответствия (пространственной комплементарности) активного центра антитела и антигенного эпитопа. Мерой аффинитета служит константа равновесия реакции их взаимодействия.

Авидность антител — суммарная сила взаимодействия антитела с антигеном. Антитела содержат от двух до десяти антигенсвязывающих центров. Поливалентность антител существенно усиливает прочность их соединения с антигеном, поскольку для диссоциации образующихся комплексов необходим разрыв сразу всех связей. Применительно к физиологическим условиям более адекватно рассматривать авидность, а не аффинность антител.

В отдельных случаях одни антитела могут распознавать вариабельные участки других антител, составляющие их активные центры. Поскольку нет двух В-клеточных клонов, продуцирующих антитела одной и той же специфичности, то разные вариабельные участки активных центров являются, по существу, маркерами разных клонов В-лимфоцитов. Такие участки называют идиотипами (idios (греч.) — собственный, частный). Идиотип — вариант уникального антигенсвязывающего участка молекулы иммуноглобулина. В организме могут нарабатываться антитела против собственных идиотипов, поскольку каждый новый идиотип является антигеном, с которым иммунная система никогда ранее не встречалась. Антиидиотипические антитела, с одной стороны, взаимодействуют с идиотипом, с другой стороны, сами являются новым антигеном для иммунной системы и могут вызывать иммунный ответ на собственный активный центр. Это приводит к возможному появлению антител уже к их идиотипу. Таким образом, формируется антиидиотипическая сеть, несущая иммунорегуляторные функции. В настоящее время этот эффект используется в практической иммунобиотехнологии и лечении некоторых заболеваний.

Биологические функции антител

1. Нейтрализация вирусов.

— Связываются с вирусами, предотвращая их проникновение в клетку и последующую репликацию.

— Вызывают агрегацию вирусов с последующим поглощением фагоцитирующими клетками.

— Взаимодействуют с клеточными рецепторами вирусов, ингибируя связывание вирусов с клеточной поверхностью.

— Блокируют межклеточное проникновение вирусов.

— Обладают ферментативными свойствами.

Антитела особенно эффективны в тех случаях, когда вирусу для достижения клеток-мишеней необходимо пройти через кровоток. Тогда эффективными могут быть даже относительно низкие концентрации антител в крови. Поэтому наиболее очевидный защитный эффект антител наблюдается при инфекциях с длительным инкубационным периодом, когда вирус, прежде чем достичь клеток-мишеней, должен пройти через кровоток, где может быть нейтрализован даже очень небольшим количеством специфических антител.

2. Нейтрализация токсинов. Циркулирующие в крови продукты бактериального происхождения и другие экзотоксины (например, фосфолипаза пчелиного яда) связываются направленными против них антителами. Антитело, присоединившись вблизи активного центра токсина, может блокировать его взаимодействие с субстратом. Даже связываясь с токсином на некотором расстоянии от его активного центра, антитела могут подавить токсичность в результате аллостерических конформационных изменений. В комплексе с антителами токсин теряет способность к диффузии в тканях и может стать объектом фагоцитоза.

3. Опсонизация бактерий. Опсонизация — связывание антител с антигенами поверхности бактерий. В результате опсонизации бактерии становятся объектом интенсивного поглощения фагоцитирующими клетками. Действие антител усиливается белками системы комплемента, которые также связываются с бактериальной поверхностью. (Белки системы комплемента могут и самостоятельно опсонизировать бактерии.) На фагоцитирующих клетках имеются рецепторы для Fc-участков иммуноглобулинов и рецепторы для белков комплемента.

4. Активация системы комплемента. Связываясь с поверхностью клеток, антитела классов IgM и IgG приобретают способность инициировать классический путь активации комплемента. Активация приводит к отложению белков системы комплемента на поверхности бактериальных клеток, образованию пор в мембране и гибели клеток с последующим привлечением к месту событий фагоцитов и поглощением клеток фагоцитами.

5. Антителозависимая клеточная цитотоксичность. Антитела, связавшиеся с чужеродными антигенами на поверхности клеток, приобретают способность взаимодействовать с Fc-рецепторами на мембране цитотоксических клеток (естественные киллеры, цитотоксические Т-лимфоциты). Примерами мембранных чужеродных антигенов могут служить вирусные белки, появляющиеся на поверхности вирусинфицированных клеток. В результате взаимодействия антигена с антителом и Fc-рецептором образуется мостик, сближающий клетку-мишень и цитотоксическую клетку. После сближения цитотоксическая клетка убивает клетку-мишень.

6. Защита от паразитов. Существуют паразиты, слишком крупные, чтобы их можно было уничтожить путем фагоцитоза, например гельминты. Выделяемые паразитом антигены могут взаимодействовать с IgE, связанными через соответствующий рецептор с тучными клетками. В результате такого взаимодействия тучные клетки выбрасывают медиаторы, привлекающие эозинофилы. Последние уничтожают или нейтрализуют гельминтов путем выброса во внеклеточное пространство специфических эффекторных молекул.

7. Иммунорегуляторная функция. Антиидиотипические антитела взаимодействуют с активными центрами других антител (идиотипами) и осуществляют регуляцию гуморального иммунного ответа, подавляя их активность.

8. Проникновение через плаценту. В эмбриональный период и первые несколько месяцев жизни, когда собственная иммунная система ребенка еще недостаточно развита, защиту от инфекций обеспечивают материнские антитела, проникающие через плаценту или поступающие с молозивом и всасывающиеся в кишечнике. Через плаценту в кровь плода поступают антитела класса IgG. Основные классы иммуноглобулинов грудного молока — это IgG и секреторный IgA. Они не всасываются в кишечнике, а остаются в нем, защищая слизистые оболочки. Эти антитела направлены к бактериальным и вирусным антигенам, часто попадающим в кишечник.

Поликлональные и моноклональные антитела. Сыворотку крови, содержащую антитела к какому-либо антигену, называют антисывороткой. Антисыворотка, как правило, поликлональна, поскольку содержит антитела, продуцируемые разными клонами плазматических клеток. Антисыворотку обычно получают путем иммунизации организма каким-либо антигеном. Поликлональная антисыворотка может быть моноспецифической, то есть содержащей антитела к разным эпитопам одного и того же антигена. Например, выпускают поликлональные моноспецифические антисыворотки против тяжелых цепей иммуноглобулинов М, G, А человека. Каждая такая антисыворотка содержит поликлональные антитела, направленные к различным эпитопам какой-либо цепи иммуноглобулинов.

Моноклональные антитела продуцируются одним клоном плазмоцитов. Разработан метод получения больших количеств моноклональных антител с помощью, так называемой гибридомной технологии, являющейся одной из составляющих клеточной инженерии. Гибридомы являются бессмертными клеточными клонами, продуцирующими антитела одной специфичности.

Моноклональные антитела идентичны по своему строению, то есть относятся к одному и тому же классу, изотипу, аллотипу, имеют одинаковые активные центры, обладают одной и той же специфичностью, взаимодействуют с одним и тем же эпитопом антигена с одинаковой аффинностью. Моноклональные антитела могут нарабатываться в неограниченных количествах и используются в качестве

Существует два типа перекрестной реактивности антител.

— Антитела, направленные против какого-либо антигена одного вида животных, могут реагировать с антигенами другого вида. Причиной такой перекрестной реактивности является консервативность гомологичных биологических структур, например, белков, сохраняющих свою аминокислотную последовательность неизменной в процессе эволюции. Так, известен высоко консервативный белок, называемый Thy-1 антигеном и характерный для клеток тимуса позвоночных. Моноклональные антитела, взаимодействующие с Thy-1 антигеном человека, реагируют с Thy-1 антигеном земноводных и пресмыкающихся.

— Антитела, взаимодействующие со стереохимически сходными эпитопами, имеющими разную природу. Так, стрептококки несут антигены, конформационно сходные с антигенами сердечных клапанов. В результате, у лиц, перенесших стрептококковую ангину, может развиться ревматизм сердца вследствие наработки в организме перекрестно реагирующих антител к собственным антигенам. Такие антитела называют также аутоантителами, то есть антителами, направленными против собственных антигенов. В здоровом организме аутоантитела обычно присутствуют в следовых количествах.

Наличие эффекта перекрестного реагирования создает определенные трудности в оценке диагностической специфичности.

Иммуноглобулины отличаются от других белков исключительным полиморфизмом. Полиморфизм проявляется в наличии разных изотопов, аллотипов иммуноглобулинов, а также в разнообразии активных центров антител (идиотипов), определяющих их специфичность по отношению к антигенным детерминантам.

Во всех клетках, кроме созревающих В-лимфоцитов, кодирующая легкие и тяжелые цепи ДНК находится в так называемой «зародышевой конфигурации». Такую конфигурацию называют также генами зародышевой линии, или гаметными генами.

Тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов кодируются набором кодирующих нуклеотидных последовательностей, названных генными сегментами и разделенных друг от друга некодирующими участками ДНК. Генные сегменты являются предшественниками функционально активных генов и представляют собой экзоны, перемежающие с интронами. В ходе В-клеточного созревания эти генные сегменты перестраиваются и особым образом соединяются вместе, давая функционально активные гены цепей иммуноглобулинов. У человека и мыши существует три группы генных сегментов, обеспечивающих синтез всего многообразия тяжелых цепей иммуноглобулинов: V (variable — вариабельный), D (diversity — обеспечивающий разнообразие) и J (joining — соединительный). Сегменты расположены последовательно группами от 5' к 3' концу. Аналогичным образом выглядит зародышевая конфигурация ДНК, кодирующей легкие цепи.

Весь путь созревания В-лимфоцита от незрелой клетки-предшественницы до антителосекретирующей плазматической клетки можно разделить на несколько этапов.

1. Соматическая рекомбинация — перестройка (реаранжировка) генных сегментов, кодирующих вариабельные домены цепей иммуноглобулинов. Это первый этап на пути к синтезу антител и ключевой момент формирования функциональных вариабельных областей легких и тяжелых цепей. Соматическая рекомбинация идет на ранних этапах созревания В-лимфоцитов в костном мозге с участием специализированных ферментов. В результате соматической рекомбинации объединяются генные сегменты, кодирующие вариабельные домены цепей иммуноглобулинов. Объединенные экзоны, кодирующие V-домен, остаются при этом разделены интроном с генными сегментами, кодирующими константные домены. Соматической рекомбинации в ходе созревания В-лимфоцитов сначала подвергаются генные сегменты тяжелой цепи, затем - генные сегменты легких цепей.

Дополнительным источником разнообразия формирующихся активных центров являются включение вставок между сегментами (так называемые P и N-вставки), вариации в соединении сегментов, приводящие к потере или появлению новых нуклеотидов и, соответственно, к сдвигу рамки считывания, комбинации V-доменов легких и тяжелых цепей при сборке полной молекулы иммуноглобулина и, наконец, соматические гипермутации, происходящие позднее в более зрелых В-клетках. В перестроенных генах гипервариабельные участки V-доменов иммуноглобулинов кодируются последовательностями, находящимися на границе между сегментами. Гипервариабельность этих участков связана с тем, что дополнительные механизмы формирования разнообразия затрагивают именно эти районы нуклеотидной последовательности.

Перестройка генов легких и тяжелых цепей происходит только в одной из двух гомологичных хромосом. Это обеспечивает аллельное исключение в отношении продуцируемых клеткой антител. В итоге одна В-клетка и ее потомство способны продуцировать только иммуноглобулины, имеющие идентичные активные центры.

2. Синтез цепей иммуноглобулинов. Образуется первичный транскрипт РНК, содержащий нуклеотидные последовательности, включающие некодирующие интроны и генные сегменты, кодирующие домены иммуноглобулинов. Первичный транскрипт процессируется с удалением всех участков нуклеотидной последовательности кроме тех, которые кодируют вариабельный и константные домены мю-цепи. Образовавшаяся матричная РНК транспортируется из ядра в цитоплазму, где происходит синтез мю-цепей на полирибосомах шероховатого эндоплазматического ретикулюма. Мю-цепи после синтеза заякореваются на мембране эндоплазматического ретикулюма и объединяются с суррогатным полипептидом, заменяющим им легкую цепь. Затем происходит перестройка гена легкой цепи. На этой стадии В-лимфоцит представляет собой пре-B клетку. Синтез легкой цепи приводит к появлению на мембране лимфоцита полноценного мембранного IgM и к переходу В-лимфоцита в стадию незрелой B-клетки. Созревание в зрелую наивную B-клетку сопровождается одновременным появлением на клетке мембранного IgM и IgD. Они имеют один и тот же активный центр, но разные константные домены, образующиеся за счет альтернативного сплайсинга матричной РНК. Обе формы мембранного иммуноглобулина входят в состав В-клеточных рецепторов. В-лимфоцит, экспрессирующий (несущий на мембране) B-клеточный рецептор, выходит из костного мозга и приобретает способность активироваться при встрече с антигеном, взаимодействующим с активным центром иммуноглобулина.

3. Дополнительные модификации. Зрелые наивные В-клетки мигрируют в лимфоузлы и другие лимфоидные органы, где в результате встречи с антигеном происходит их активация. Активация приводит к трем дополнительным событиям, затрагивающим перестроенные гены иммуноглобулинов и характер их экспрессии:

— Переключение изотипа. Путем альтернативного сплайсинга матричной РНК генные сегменты, кодирующие мю-цепи и дельта-цепи, удаляются. На их место перемещаются сегменты, кодирующие константные домены тяжелых цепей других изотипов. В результате взамен иммуноглобулинов классов М и D В-клетки начинают синтезировать иммуноглобулины класса G, А или Е. Такие иммуноглобулины имеют тот же активный центр (вариабельный домен), но принадлежат к другому изотипу. Каждый В-лимфоцит в этом случае синтезирует иммуноглобулины только одного изотипа. Переключение изотипов регулируется цитокинами.

— Образование растворимых иммуноглобулинов (антител). Активация В-лимфоцитов приводит к их превращению в плазматические клетки — конечный этап дифференцировки В-клеток. Плазматические клетки теряют способность продуцировать мембранную форму иммуноглобулинов, но начинают синтез растворимых иммуноглобулинов.

— Соматические гипермутации. Затрагивают только гипервариабельные участки, кодирующие V-домены. Происходят в зародышевых (терминальных) центрах лимфоузлов, где концентрируются активированные В-клетки. Скорость мутаций вариабельных участков в генах легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов на несколько порядков превышает нормальный темп мутаций. Одна мутация возникает в среднем за два клеточных деления. Клетки делятся каждые 6 часов. Механизм соматических гипермутаций остается неизвестным.

Иммунологические методы анализа построены на взаимодействии антиген-антитело. С помощью таких методов можно выявлять как антитела, так и антигены. Определение может быть качественным и количественным. Эта группа методов не требует большого количества материала для анализа (микроанализ). Объем анализируемого материала в наиболее совершенных методах составляет 0,1 мл, а чувствительность достигает десятых долей нанограмма на миллилитр.

1. Иммунопреципитация. Метод основан на поливалентности антител. За счет наличия нескольких активных центров в составе иммуноглобулинов они могут взаимодействовать с одинаковыми эпитопами на нескольких антигенах. В результате образуются видимые глазом и выпадающие в осадок агрегаты (преципитат). Если антиген содержит несколько эпитопов, то с ним связывается несколько антител, что увеличивает массу агрегата. Различают иммунопреципитацию в растворе (наименее чувствительная) и преципитацию в геле (позволяет определять антитела и антигены с более высокой чувствительностью.Таким способом можно определить наличие или отсутствие в пробе антигена или антител.

Радиальная иммунодиффузия. В этом случае подготавливается плоский гель, в котором один из компонентов системы антиген-антитело размещен равномерно по всей толще геля. Второй компонент, тестируемый в системе антиген-антитело, помещают в лунку в центре плоского геля. Последующая диффузия тестируемого компонента приводит к образованию кольца преципитации вокруг центральной лунки. Чем выше концентрация тестируемого компонента, тем больше диаметр образующегося кольца. При использовании соответствующих калибровочных образцов, то есть набора проб с известной концентрацией, может быть проведено количественное определение компонента, наносимого в центральную лунку.

Иммуноэлектрофорез. Метод является качественным. С его помощью можно одновременно в одной пробе определить наличие множества антигенов, выявляемых антителами. Проводят электрофорез тестируемого образца в агарозном геле, затем по сторонам геля параллельно направлению миграции антигенов делают длинные лунки (траншеи), в которые заливают антисыворотку, содержащую антитела к тестируемым антигенам. При наличии в тестируемом образце искомых антигенов образуются дуги преципитации в тех зонах, куда мигрировали при электрофорезе антигены. Этим же методом можно определить наличие антител к конкретному антигену, находящемуся в смеси с другими антигенами.

Агглютинация (от лат. agglutinatio — склеивание). В основе метода лежит формирование видимых невооруженным глазом конгломератов клеток или частиц при образовании между ними молекулярных мостиков. В качестве мостиков могут выступать антитела и антигены. В основе феномена агглютинации лежит поливалентность антител, дающая возможность одному антителу связаться с несколькими клетками или частицами одновременно. Агглютинация может происходить между бактериальными клетками, между клетками крови, в частности эритроцитами, между латексными частицами. Бактериальные клетки несут поверхностные антигены. При добавлении к бактериальным клеткам антител против таких антигенов будет происходить их агглютинация. Определение групп крови с помощью соответствующих антисывороток также основано на феномене агглютинации. В этом случае образование конгломератов клеток с последующим их осаждением происходит в том случае, когда эритроциты несут на своей поверхности антигены (изоагглютинины), взаимодействующие с добавляемой к ним антисывороткой. При агглютинации эритроцитов метод называют гемагглютинацией.