Биологические методы.
Выделение РНК проводилось c помощью набора RNeasy Plus Mini Kit (фирмы Qiagen). Кусочек ткани не более 30 мг помещали в пробирку Эппендорф на 1,5 мл и гомогенизировали вручную пестиком в 600 мкл RLT Plus Buffer, содержащем гуанидин-изотиоцианат и бета-меркаптэтанол. Первый является одним из самых мощных денатурантов белка и очень эффективен при очистке РНК из-за его способности быстро проникать в клетки и подавлять активность РНКаз [1]. Бета-меркаптэтанол инактивирует РНКазы, восстанавливая дисульфидные связи, и тем самым препятствует разрушению РНК. Затем центрифугировали полученный лизат в течение 3 минут при 13,4 g (?), отбирали 350 мкл супернатанта с помощью пипетки и переносили в gDNA Eliminator spin column, в которой происходила абсорбция геномной ДНК. Колонку, установленную в пробирку, центрифугировали 30 сек (указать величину g). Колонку выкидывали, а к собранному в пробирке раствору РНК добавляли равный объем 70% этанола. Переносили 700 мкл образца в RNeasy Spin column, в которой происходила адсорбция суммарной РНК, ставили колонку в пробирку и центрифугировали 15 сек, содержимое пробирки сливали. Затем добавляли в RNeasy Spin column 700 мкл RW1 Buffer, содержащий небольшое количество гуанидин-изотиоцианата для промывки колонки, и центрифугировали 15 сек, содержимое пробирки сливали. Затем добавляли в RNeasy Spin column 500 мкл RPE Buffer и центрифугировали 15 сек, сливали содержимое пробирки, и опять добавляли 500 мкл RPE Buffer и центрифугировали 2 мин, тем самым добиваясь полного очищения РНК от всех примесей. Переносили RNeasy Spin column в новую пробирку и центрифугировали 1 мин (ничего не добавляли?). Меняли пробирку на конечную и наносили на колонку 50 мкл свободной от РНКаз воды (RNase-free water) для десорбции суммарной РНК, центрифугировали 1 мин. Колонку выкидывали, а Эппендорф с выделенной РНК хранили при -20оС до процедуры обратной транскрипции.
