Оценка уровня экспрессии гена Nqo1 в разных группах (метод 2-ΔΔСТ). Методику расчета перенести в методы

Для сравнения уровня экспрессии в исследуемых образцах использовали метод относительного количественного определения экспрессии гена (метод 2^-ΔΔСТ) (Livak K., Schmittgen T., 2001). Суть метода заключается в том, что…

Уравнение, которое описывает накопление продукта ПЦР:

где - количество молекул-мишеней на цикле n, - начальное количество молекул-мишеней. – эффективность амплификации молекул-мишеней, n –номер цикла. Пороговый цикл реакции (С_Т) цикл начала увеличения флуоресценции, т.е. накопление молекул-мишений, на котором сигнал уже достоверно отличим от приборного шума, но при этом еще наблюдается экспоненциальный рост сигнала

где пороговое количество молекул-мишеней, пороговый цикл при амплификации молекул-мишеней, а это константа. Аналогичное уравнение получаем для реакции накопления продуктов амплификации гена сравнения (reference, ген «домашнего хозяйства» - описать, что это такое в сути метода)

где это пороговое количество молекул контроля (гена домашнего хозяйства), - начальное количество молекул контроля, эффективность амплификации молекул контроля, пороговый цикл для амплификации молекул контроля, а это константа.

Если поделить на , получим

Сделаем допущение, что эффективности реакций ПЦР-РВ во всех образцах равны.

или

где это нормализованное количество молекул-мишений, а равна разности пороговых циклов мишеней и контроля.

Так, получаем экспрессию

Завершающий шаг – это деление для образца q (кормление которого производилось исследуемым сырьем) на для калибровочного образца (cb) (которого никаким исследуемым сырьем не кормили):

Где .

Для ампликонов с протяженностью менее чем 150 bp и для которых концентрация праймера и Mg²⁺ подобраны верно, эффективность близка 1. Поэтому, количество мишеней, нормализованное на внутренний контроль и отнесенное к калибратору, выражается формулой

В нашей работе была достигнута эффективность, равная ….. для амплификации Nqo1 и …. для амплификации Gapdh.