Современные методы исследования биологических структур. Электронная микроскопия, предел разрешения электронного микроскопа. Рентгеноструктурный анализ, формула Вульфа - Брэггов

Вопрос 7. Представления о войне и международных отношениях.

Вопрос 8. Общая оценка политической теории Гегеля.

Современные методы исследования биологических структур. Электронная микроскопия, предел разрешения электронного микроскопа. Рентгеноструктурный анализ, формула Вульфа - Брэггов.

Рентгеноструктурный анализ, электронно-микроскопические исследования, флуоресцентный анализ, электронный парамагнитный резонанс, ядерный магнитный резонанс. Наибольшие успехи в раскрытии особенностей строения био­логических мембран были достигнуты в электронно-микроскопи­ческих исследованиях. В электронном микроскопе вместо светового пучка на иссле­дуемый объект направляется пучок электронов, разогнанных до больших скоростей.

Известно, что электронам с высокими скоростями тоже прису­щи волновые свойства, в том числе явление дифракции. Однако при достаточно больших скоростях, согласно формуле де Бройля, длина волны мала и соответственно мал предел разрешения. Так, если электроны ускоряются электрическим полем с напряжением 10⁵В, их скорость достигает 10⁶ м/с, длина волны уменьшается, и предел разрешения составляет порядка 0,1 нм, что позволяет рас­смотреть отдельные детали строения биологических мембран.

В электронном микроскопе достигается увеличение в сотни тысяч раз, что дало возможность исследовать строение клет­ки, клеточных органелл и биологических мембран.

Недостатком электронной микроскопии является деформация живого объекта в процессе исследования. Перед началом электронно-микроскопических исследований клетка проходит через многие стадии предварительной обработки: обезвоживание, за­крепление, ультратонкий срез, обработка препаратов вещества­ми, хорошо рассеивающими электроны (например, золотом, се­ребром, осмием, марганцем и т.п.). При этом изучаемый объект значительно изменяется. Несмотря на это, успехи в изучении клетки при помощи электронного микроскопа несомненны.

Рентгеноструктурный анализ позволяет обнаруживать упорядоченность в распо­ложении атомов и определять параметры упорядоченных структур (например, расстояния между кристаллографически­ми плоскостями). Исследования дифракции рентгеновских лу­чей на мембране подтвердили относительно упорядоченное расположение липидных молекул в мембране — двойной молекуляр­ный слой с более или менее параллельно расположенными жирно-кислыми хвостами, дали возможность точно определить рас­стояние между полярной головой липидной молекулы и метильной группой в конце углеводородной цепи.

 

3. Фазовое состояние фосфолипидов в мембране. Фазовые переходы мембранных липидов. Модельные липидные мембраны: плоские бислойные липидные мембраны (БЛМ), липосомы; их использование для изучения свойств биологических мембран. Липосомы в медицине.

Липидные бислойные мембраны при физиологических усло­виях - жидкие, время оседлой жизни фосфолипидных моле­кул в мембране мало: т = 10~⁷ - 10~⁸ с. Бислойная липидная фаза биологических мембран соответ­ствует смектическому жидкокристаллическому состоянию (расположены упорядочено). При понижении температуры происходит переход из жидкокристаллическо­го в гель-состояние, которое условно иногда называют твердокристаллическим В гель - состоянии молекулы расположены еще более упо­рядочено, чем в жидкокристаллическом.. В жидком кристалле за счет теплового движения возможны транс-гош-переходы, хвосты молекул изгибаются, их параллельность друг другу в отдель­ных местах нарушается, особенно сильно в середине мемб­раны. Для нормального функционирования мембрана должна быть в жидкокристаллическом состоянии. Поэтому в живых систе­мах при продолжительном понижении температуры окружаю­щей среды наблюдается адаптационное изменение химического состава мембран, обеспечивающее понижение температуры фа­зового перехода. Температура фазового перехода понижается при увеличении числа ненасыщенных связей в жирно-кислотных хвостах. В хво­сте молекулы может быть до четырех ненасыщенных связей, фосфолипидов. Липосомы, или фосфолипидные везикулы (пузырьки), полу­чают обычно при набухании сухих фосфолипидов в воде или при впрыскивании раствора липидов в воду. При этом проис­ходит самосборка бимолекулярной липидной мембраны. Отдельные бимолекулярные слои многослойной липосомы отделены водной средой. Толщина липидных слоев составля­ет, в зависимости от природы липидов, 6,5 - 7,5 нм, а расстоя­ние между ними - 1,5 - 2 нм. Диаметр многослойных липосом колеблется в пределах от 60 нм до 400 нм и более. Липосомы нашли непосредственное применение в медици­не. Например, можно заключить внутрь липосом лекарствен­ный препарат и использовать как фосфолипидную микрокап­сулу для доставки лекарства в определенные органы и ткани.

Плоские бислойные липидные мембраны (БЛМ) - другой тип модельных мембран. Такие мембраны получают на ма­леньких отверстиях диаметром около 1 мм в пластинке из пла­стика (например, фторопласта), погруженной в водную сре­ду. На отверстие наносят каплю раствора липида (в спирте, хлороформе, гептане или других растворителях). Раствори­тель диффундирует из раствора в воду, и на отверстии остает­ся пленка липида. Эта пленка спонтанно утончается до тех пор, пока не образуется бимолекулярный слой толщиной око­ло 6 нм. Лишний липид собирается в виде ободка-торуса у кра­ев отверстия Плоские липидные мембраны, наряду с липосомами, широ­ко используются в качестве моделей для изучения электри­ческих свойств мембраны, их проницаемости и других науч­ных исследований. С помощью модельных мембран изучают ряд функций биологических мембран, а том числе, барьерную (например, селективность проницаемости - хорошую прони­цаемость для воды и плохую для ионов). Можно моделировать биологический транспорт, вводя в модельную мембрану мо­лекулы-переносчики.

 

4. Диффузия липидных молекул в мембранах: латеральная, флип - флоп. Частота перескоков молекул. Люминесцентные методы изучения подвижности молекул в мембране, флуоресцентные метки и зонды.

Латеральная диффузия - это хаотическое тепловое перемещение молекул липидов и белков в плоскости мембраны. При латеральной диффузии рядом рас­положенные молекулы липидов скачком меняются местами, и вследствие таких последовательных перескоков из одного мес­та в другое молекула перемещается вдоль поверхности мемб­раны. Среднее квадратичное перемещение S кв. молекул при диф­фузии за время t можно оценить по формуле Эйнштейна:

Перемещение молекул по поверхности мембраны клетки за время t определено экспериментально методом флуоресцентных меток - флюоресцирующих молекулярных групп. Флуоресцентные метки делают флюоресцирующими молекулы, дви­жение которых по поверхности клетки можно изучать, например, исследуя под микроскопом скорость расплывания по поверхности клетки флюоресцирующего пятна, созданного такими молекулами.

Частота перескоков (число перескоков в секунду) молекулы с одного места на другое вследствие латеральной диффузии может быть найдена по формуле: где f - площадь, занимаемая одной молекулой на мембране.

Флип-флоп - это диффузия молекул мембранных фосфолипидов поперек мембраны.

Скорость перескоков молекул с одной поверхности мембра­ны на другую (флип-флоп) определена методом спиновых ме­ток в опытах на модельных липидных мембранах - липосомах Часть фосфолипидных молекул, из которых формировались липосомы, метились присоединенными к ним спиновыми мет­ками. Липосомы подвергались воздействию аскорбиновой кис­лоты, вследствие чего неспаренные электроны на молекулах пропадали: парамагнитные молекулы становились диамагнит­ными, что можно было обнаружить по уменьшению площади под кривой спектра ЭПР.

Таким образом, перескоки молекул с одной поверхности бислоя на другую (флип-флоп) совершаются значительно медлен­нее, чем перескоки при латеральной диффузии. Среднее время, через которое фосфолипидная молекула совершает флип-флоп (Т ~ 1 час), в десятки миллиардов раз больше среднего времени, характерного для перескока молекулы из одного места в сосед­нее в плоскости мембраны.

 

 

5. Электрохимический потенциал. Транспорт веществ через биологическую мембрану: пассивный и активный, принципиальные различия между ними.

Химическим потенциалом данного вещества Мю называется величина, численно равная энергии Гиббса, приходящаяся на один моль этого вещества. Математически он определяется как частная производная от энергии Гиббса G по количеству k-го вещества, при постоянстве температуры Т, давления Р и количеств всех других веществ m1 (l не = k):

Пассивный транспорт - это перенос вещества из мест с боль­шим значением электрохимического потенциала к местам с его меньшим значением.

Пассивный транспорт идет с уменьшением энергии Гиббса, и поэтому этот процесс может идти самопроизвольно без затра­ты энергии. Плотность потока вещества j при пассивном транспорте под­чиняется уравнению Теорелла: где U - подвижность частиц, С - концентрация. Знак минус показывает, что перенос происходит в сторону убывания Мю. Плотность потока вещества - это величина, численно равная количеству вещества, перенесенного за единицу времени через единицу площади поверхности, перпендикулярной направле­нию переноса:

Уравнение Нернста—Планка:

Активный транспорт — это перенос вещества из мест с мень­шим значением электрохимического потенциала в места с его большим значением.

Активный транспорт в мембране сопровождается ростом энергии Гиббса, он не может идти самопроизвольно, а только в сопряжении с процессом гидролиза аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ), то есть за счет затраты энергии, запасенной в макроэргических связях АТФ. Активный транспорт веществ через биологические мембра­ны имеет огромное значение.За счет активного транспорта в организме создаются градиенты концентраций, градиенты электрических потенциалов, градиенты давления и т.д., под­держивающие жизненные процессы, то есть с точки зрения тер­модинамики активный перенос удерживает организм в нерав­новесном состоянии, поддерживает жизнь.