Механизмы функционирования рецепторов

 

4.1Функционирование рецепторов – каналов

Среди рецепторов – каналов наиболее хорошо изучены никотиновые ацетилхолиновые рецепторы, находящиеся на постсинаптической мембране нервно – мышечного соединения. Он является первым ионным каналом, который был выделен в чистом виде, и для которого впервые была определена аминокислотная последовательность. Впервые этот канал использовался для реконструкции в липидный бислой, для него впервые был записан сигнал во время открывания одиночного канала. Успехи в изучении этого типа каналов связаны с тем, что обнаружился источник, богатый никотиновыми ацетилхолиновыми рецепторами – электрические органы скатов и других электрических рыб. Кроме того, нашли эффективный молекулярный «инструмент» для изучения этих каналов – a-бунгаротоксин (нейротоксин яда некоторых змей), который является блокатором этих каналов.

Никотиновый ацетилхолиновый рецептор представляет собой гликопротеин, состоящий из 5 субъединиц (2a, b, g, d), которые кодируются 4 разными генами. Он имеет 2 участка для связывания ацетилхолина. Связывание 2 молекул ацетилхолина с рецептором вызывает его конформационные изменения, что приводит к открыванию канала. Время открытого состояния канала составляет примерно 1 мсек. Канал не обладает высокой селективностью: он может пропускать ионы натрия, калия и кальция, но не анионы. Ток положительных ионов через канал вызывает деполяризацию постсинаптической мембраны, что, в свою очередь, приводит к открыванию потенциалозависимых натриевых каналов и генерации потенциала действия.

4.2 Особенности рецепторов, связанных с G – белками

Функционирование рецепторов, сопряженных с G – белками, связано с продуцированием вторичных посредников.

Эти рецепторы имеют 7 трансмембранных доменов, каждый из которых содержит 20 – 25 аминокислотных остатков, образующих a - спираль. Кроме этого, имеется 8 гидрофильных доменов, которые представляют собой чередующиеся внеклеточные и цитоплазматические петли.

N – концевой домен рецептора, расположенный на внешней стороне мембраны, имеет участки для гликозилирования, в то время как цитоплазматические петли обогащены остатками серина и треонина, которые служат мишенями для протеинкиназ. G – белок взаимодействует с тремя цитоплазматическими петлями рецептора. Большинство авторов считает, что взаимодействие рецептора и G – белка является гидрофобным, однако определенный вклад в эти отношения вносят и электростатические силы.

Рецепторы и связанные с ними a - субъединицы G-белков подвергаются в клетке различным модификациям, что вызывает изменения в их структуре. Благодаря этому осуществляется тонкая регуляция процесса сигнальной трансдукции. Примером такой модификации является фосфорилирование различных локусов рецептора протеинкиназами, что вызывает появление отрицательных фосфорных групп и, вследствие этого, изменение заряда вдоль фосфорилированной аминокислотной последовательности. Результатом этого является дестабилизация a - спирали рецептора и изменение отношений с G – белком (рис. 21).

4.3 ГТФ – связывающие белки (G – белки)

ГТФ – связывающие белки или G – белки являются гетеротримерными, состоят из a, b и g - субъединиц, взаимодействуют и с рецептором и с эффектором. a - субъединицы участвуют в формировании домена для связывания гуаниновых нуклеотидов и обладают ГТФазной активностью.

В неактивном состоянии a - субъединица G – белка связана с ГДФ. Присоединение агониста к рецептору вызывает изменение его конформации, вследствие чего рецептор связывается с G – белком. Образование комплекса G – белка с рецептором приводит к тому, что ГДФ меняется на ГТФ. Результатом является активация G – белка: он отделяется от рецептора и диссоциирует на a - субъединицу и bg - комплекс. Связанная с ГТФ a - субъединица присоединяется к белку – эффектору и изменяет его активность. В роли белков – эффекторов выступают аденилатциклаза, фосфолипаза С, белки ионных каналов, обменников и др. В результате описанного взаимодействия может измениться синтез вторичных посредников, ионная проницаемость мембраны и др. Переход G – белка в неактивное состояние происходит благодаря гидролизу ГТФ. Как только осуществится замена ГТФ на ГДФ a - субъединица теряет свою активность, отсоединяется от белка – эффектора и ассоциируется с bg - комплексом (рис.22).

По действию на аденилатциклазу было установлено наличие двух типов G – белков: активирующие (G_S – белки) и ингибирующие (G_i – белки). В качестве молекулярных инструментов для различения этих белков используют бактериальные токсины.

Так, холерный токсин оказывает воздействие на G_S – белки, а коклюшный токсин – на G_i – белки. Оба токсина содержат фермент АДФ – рибозилазу. АДФ – рибозилирование a - субъединицы G_S – белка приводит к ее необратимой активации, т.к. препятствует гидролизу ГТФ. Итогом этого является активация аденилатциклазы и непрекращающаяся наработка цАМФ. АДФ – рибозилирование ингибирующего G_i – белка препятствует диссоциации его на a - субъединицу и bg - комплекс. Результатом является устранение ингибирующего действия G_i – белка на аденилатциклазу и продолжение выработки цАМФ.

 

В последнее время выявили еще одно семейство G – белков – так называемые Rho – белки или мономернве G – белки. Их особенностью является то, что они обладают ГТФазной активностью, но состоят из одной субъединицы и активируют так называемые Rho – киназы.

 

4.4 Функционирование каталитических рецепторов, проявляющих, ферментативную активность

Одним из важнейших классов каталитических рецепторов являются рецепторы, проявляющие тирозинкиназную активность (рецепторные тирозинкиназы) (рис. 23).

 

Рис. 23. Механизмы активации димерных рецепторов, связанных с тирозинкиназой.

 

Агонистами этих рецепторов являются либо факторы роста, либо гормоны. Главная функция рецепторных тирозинкиназ – каскадная передача сигналов, регулирующих пролиферацию и дифференцировку клеток, а также процессы клеточного метаболизма. Особое значение рецепторных тирозинкиназ – участие в опухолевом процессе. Факторы роста продуцируются опухолевой клеткой и действуют на ее же рецепторы (аутокринная регуляция) или соседние клетки (паракринная регуляция).

Рецепторная тирозинкиназа имеет 3 основных домена:

· внеклеточный N – концевой участок, который гликолизирован и является агонист – связывающим участком, обеспечивающий специфичность восприятия сигнала;

· собственно трансмембранный участок, состоящий из гидрофобных аминокислот;

· внутриклеточный тирозиновый домен, аналогичный у всех рецепторных тирозинкиназ.

 

 

Связывание лиганда в большинстве случаев приводит к димеризации неактивных мономерных рецепторов и к трансаутофосфорилированию тирозиновых остатков цитозольных доменов рецептора. Фосфотирозин рецепторной тирозинкиназы играет ключевую роль в дальнейшей передаче сигнала к внутриклеточным сигнальным молекулам (рис. 23).

Другим примером каталитического рецептора является мембранно-связанная гуанилатциклаза. Фермент состоит из внеклеточного рецепторного домена, одиночного a - спирального трансмембранного сегмента и внутриклеточного каталитического домена. В качестве агонистов этого фермента выступают некоторые биогенные пептиды:

· натрийуретический пептид, регулирующий гомеостаз жидкости в организме и кардиососудистую функцию;

· пептиды, секретируемые яичниками и стимулирующие подвижность сперматозоидов;

· термостабильные энтеротоксины из E. сoli.

Связывание этих агонистов с внеклеточным рецепторным доменом приводит к димеризации рецепторов и активации каталитического домена. Субстратом мембранно-связанной гуанилатциклазы является ГТФ, который превращается ферментом в 3^’,5^’ – циклический гуанозинмонофосфат (цГМФ) (рис. 24).

 

5.Вторичные посредники в роли регуляторов клеточной активности

 

5.1 Циклические нуклеотиды в роли вторичных посредников

Первым соединением, которое получило статус вторичного посредника, был 3^’,5’-циклический аденозинмонофосфат (цАМФ), открытый Е. Сазерлендом в 50х годах ХХ века в ходе работ по выяснению механизма стимуляции гликогенолиза адреналином. После открытия цАМФ был обнаружен фермент, катализирующий превращение АТФ в цАМФ в присутствии ионов Mg²⁺ (аденилатциклаза) (рис. 25), а также фермент, осуществляющий инактивацию цАМФ путем превращения его в 5^’-АМФ (фосфодиэстераза).

Оказалось, что, кроме гликогенолиза, существует множество процессов, осуществляемых в разных клетках при участии цАМФ. Приведем некоторые примеры биологических эффектов цАМФ:

· Изменение проницаемости мембран

· Синтез стероидных гормонов корой надпочечников

· Секреторные реакции экзо- и эндокринных желез

· Транскрипция генов

· Перемещение внутриклеточных структур

· Подвижность и агрегация у одноклеточных организмов

В начале «эры» цАМФ Е.Сазерленд с соавторами выработали критерии, на основании которых устанавливается участие этого соединения в ответе клетки на химическую стимуляцию. Другими словами, были сформулированы критерии вторичного посредника, которые можно распространить и на другие сигнальные внутриклеточные молекулы.

1. Химический агент должен стимулировать активность аденилатциклазы в препаратах чувствительной ткани.

2. В ответ на действие химического агента должна возрастать концентрация цАМФ в ткани.

3. Косвенное доказательство участия цАМФ в реакции – потенцирование гормонального эффекта ингибиторами фосфодиэстеразы.

4. Воспроизведение гормонального эффекта с помощью цАМФ или его производного (например, дибутирил-цАМФ).

5. Повышение концентрации цАМФ в ткани под влиянием гормона должно предшествовать регистрируемой биологической реакции.

Внутриклеточная концентрация цАМФ определяется не только скоростью наработки этого посредника, но и скоростью его распада. Последнюю реакцию катализирует фосфодиэстераза циклических нуклеотидов (ФДЭ).

 

Аденилатциклаза представляет собой интегральный белок, полипептидная цепь которого образует 12 гидрофобных доменов, встроенных в цитоплазматическую мембрану. Активация фермента происходит в результате взаимодействия с a-субъединицей стимулирующего ГТФ-связывающего белка. Примером рецепторов, активирующих аденилатциклазу через стимулирующий ГТФ-связывающий белок являются b-адренэргические рецепторы. α₂-адренэргические рецепторы связаны с ингибирующим ГТФ-связывающим белком (рис. 26).

Механизм влияния G_i-белка на АЦ до конца не выяснен. Есть данные, что он связан с конкурентным ингибированием a-субъединицы за счет избытка βg-субъединиц. Установлено, что G_s- и G_i-белки имеют аналогичные субъединицы βg, но a- субъединица G_i-белка не способна активировать АЦ.

Некоторые вещества способны модулировать состояние G-белков. Холерный токсин АДФ-рибозилирует G_s-белок, перево­дя его в необратимо активную форму. Коклюшный токсин, напро­тив, присоединяет комплекс АДФ-рибоза к G_i-белку, предотвра­щая его гидролиз и снижая ингибиторное влияние. Повышают активность G-белков и негидролизуемые аналоги ГТФ (в частности GTP- g-S), а так же комплексное соединение [AlF₄]^-, образую­щееяся в клетке при добавлении в среду инкубации NaF и AlCl₃.

Распад цАМФ зависит от активности фосфодиэстеразы, которая, в свою очередь, контролируется ионами Са²⁺ и кальмодулином.

Увеличение цАМФ в клетке приводит к активации цАМФ-зависимой протеникиназы (протеникиназа А). В неактивной форме этот фермент представляет собой тетрамерный белок, состоящий из двух регуляторных (R) и двух каталитических (С) субъединиц. Каталитические субъединицы приобретают активность только после диссоциации комплекса, которая происходит вследствие присоединения 4 молекул цАМФ к регуляторным субъединицам (рис. 27):

 

R₂C₂ + 4цАМФ ® (R×цАМФ₂)₂ + 2С

неактивная активная

 

Субстратами для протеникиназы А могут быть белки ионных каналов, ионообменников, транспортных АТФаз, цитоскелета, ферменты, белки рибосом, ядерные белки и др. Все эти субстраты будут фосфорилироваться протеникиназой А по остаткам серина и треонина. Фосфорилирование белков будет изменять их активность как в сторону увеличения, так и уменьшения.

На функциональное состояние цАМФ-зависимой сигнальной системы способны оказывать влияние вещества различной приро­ды. Дитерпен растительного происхождения форсколин непос­редственно активирует АЦ. Ингибиторы фосфодиэстеразы потенциируют эффекты цАМФ, замедляя процесс его распада. По­лучены синтетические соединения, способные модулировать ак­тивность ПК-А. Все названные вещества находят применение в изучении физиологии цАМФ-зависимой сигнальной системы, неко­торые используются как лекарственные вещества (спазмолитики группы теофилина, папаверин).

 

В качестве вторичного посредника может выступать другой циклический нуклеотид, а именно цГМФ. Он образуется из ГТФ с помощью фермента гуанилатциклазы. По сравнению с цАМФ-зависимыми путями регуляции цГМФ-опосредованные распространены гораздо меньше. Содержание цГМФ в клетке примерно в 10 раз ниже, чем цАМФ.

В клетках обнаружено две формы гуанилатциклазы – мембранносвязанная и растворимая (цитозольная). Рассмотрим оба пути образования цГМФ к клетке.

Первый путь связан с действием агонистов на соответствующий рецептор, который связан с гуанилатциклазой (см. классификацию рецепторов). В этом случае ГТФ-связывающие белки не участвуют в пути передачи сигнала, поскольку рецептор и гуанилатциклаза являются доменами одного и того же белка. Рецепторный домен расположен на внешней стороне мембраны, а каталитический – на ее внутренней стороне. При связывании агониста с рецептором всегда происходит активация мембранно-связанной гуанилатциклазы и наработка цГМФ. Циклический ГМФ связывается с цГМФ-зависимой протеинкиназой, который, как и протенкиназа А, относится к серин-треониновым протеникиназам. В неактивном состоянии этот фермент состоит из 2 субъединиц, которые имеют по 2 регуляторных центра. Для активации цГМФ-зависимой протеинкиназы необходимо 4 молекулы цГМФ, но при этом, в отличие от протеинкиназы А, не происходит диссоциации субъединиц.

 

Примером агониста, активирующим мембранно-связанную форму гуанилатциклазы, является натрий-уретический пептид, который секретируется клетками предсердий. Он действует на гладкомышечные клетки сосудов, вызывая их расслабление. В почках этот фактор снижает реабсорбцию Na⁺ , что увеличивает его выход с мочой.

Второй путь регуляции, опосредованный цГМФ, связан с растворимой формой гуанилатциклазы. Ее активация не зависит от взаимодействия агониста и рецептора, а осуществляется с помощью NO (оксид азота). В 80-е годы ХХ века обнаружили, что именно это соединение выступает в роли эндотелиального фактора релаксации сосудов.

Впоследствии оказалось, что NO участвует в большом числе разнообразных клеточных реакций. Многообразные роли оксида азота в организме приведены на схеме (рис. 28).

NO вырабатывается во многих клетках организма, но существует три категории клеток, в которых эта молекула также реализует свои функции:

1. эндотелиальные клетки, вырабатывающие NO, который вызывает расслабление гладкомышечных клеток сосудов;

2. клетки ЦНС, где NO участвует в передаче сигнала;

3. клетки иммунной системы, в которых NO участвует в иммунном ответе.

Эндогенный NO образуется из L-аргигина под действием NO-синтазы. Различают две формы NO-синтазы: конститутивную и индуцибельную. Различия этих ферментов приведены в таблице 4.

Рассмотрим особенности растворимой формы гуанилатциклазы. Этот фермент является сульфгидрильным белком, содержащим на своей поверхности лабильные SH-группы, которые легко окисляются. Кроме того, растворимая гуанилатциклаза – это гем-содержащий фермент. Именно гем отвечает за связывание с молекулой NO, что переводит фермент в активное состояние.

Увеличение концентрации цГМФ в клетке вследствие активации растворимой гуанилатциклазы приводит, в свою очередь, к активации цГМФ-зависимой протеинкиназы (рис. 29). Последняя, фосфорилируя белки клетки, изменяет ее функционирование. Перевод цГМФ в нециклическую форму осуществляет фермент фосфодиэстераза.

 

5.2Ионы кальция в роли вторичных посредников

О роли ионов кальция как вторичных посредников впервые заговорил Расмуссен. Сначала остановимся на вопросе, почему именно ионы кальция выступают в этой роли. Как известно, между клеткой и средой существует высокий градиент ионов кальция: его внутриклеточная концентрация составляет в среднем 10^–7 М, а внеклеточная – 10^{– 3 М. Таким образом, на мембране клетки существует градиент ионов кальция 1:10000. Вследствие действия биологически активных веществ концентрация кальция внутри клетки может быть быстро увеличена до 0,6 – 2 мкМ. Увеличение внутриклеточной концентрации ионов кальция достигается за счет открывания кальциевых каналов разного типа, мобилизации ионов кальция из внутриклеточных депо (ЭПР, митохондрии), торможения оттока ионов кальция из клетки, который осуществляется Са2+}-АТФазой.

Свое действие внутри клетки ионы кальция могут реализовывать различными путями.

Первый путь кальциевой регуляции характеризуется взаимодействием ионов кальция с кальций-связывающими белками, что изменяет активность клетки. Среди таких белков можно выделить несколько групп.

1. Кальций-связывающие белки, обладающие ферментативной активностью. Примером таких белков является мультисубстратная протеаза кальпаин, которая осуществляет ограниченный протеолиз многих белков, например, белков цитоскелета, ядерных структурных белков, многих ферментов, транспортных белков. Кальпаин вовлечен в реализацию как относительно узкоспецифичных функций (например, секреция соляной кислоты в желудке), так и таких основополагающих, как клеточная пролиферация и дифференцировка, эмбриогенез, апоптоз.

2. Кальций-фосфолипид-связывающие белки – аннексинв. Эти белки участвуют в процессах слияния и агрегации мембран и осуществляют контроль за пролиферацией и дифференцировкой клеток.

3. Кальций-запасающие белки, которые связывая ионы кальция, пассивно (в отличие от активного транспорта ионов кальция с помощью кальциевого насоса) изменяют его концентрацию внутри клетки. Примерами служат кальсеквестрин, содержащийся в поперечно-полосатых мышечных волокнах, кальретикулин, находящийся в ретикулуме.

4. Кальций-связывающие белки, входящие в состав ионных каналов. Примером может служить Са²⁺-активируемый калиевый канал, который открывается вследствие увеличения концентрации ионов кальция внутри клетки.

5. Кальций-связывающие белки, не обладающие ферментативной активностью, но регулирующие многие ферменты клетки. Наиболее известным среди таких белков является кальмодулин. Кальмодулин имеет 4 участка связывания с ионами кальция (рис. 30). Комплекс Са²⁺ -кальмодулин (Са-СаМ) изменяет активность фермента двумя путями: либо прямо взаимодействуя с ферментом-мишенью, либо активируя Са-СаМ-зависимую протеинкиназу. Примерами Са-СаМ-зависимых ферментов являются фосфодиэстераза циклических нуклеотидов, киназа легких цепей миозина, аденилатциклаза, фосфолипаза А₂, Са²⁺-АТФаза.

 

Наличие четырех неэквивалентных связывающих участков, каждый из которых может быть вакантным, оккупированным иона­ми кальция, магния или калия, допускает существование 4⁴ = 256 разновидностей комплекса металл-кальмодулин. Анализ раз­личных комбинаций этих комплексов с помощью компьютерного моделирования привел авторов к заключению, что количество физиологически значимых разновидностей металл-кальмодулино­вых соединений все же невелико: для состояния "покоя" клетки - МККК, ММКК, МММК, а для возбужденного - ССМК, СССК, ССММ, СМКК, СММК, ССКК (где С - ионы кальция, М - магния и К - ка­лия). Молярное соотношение Са/КМ определяет приоритетность отдельных конформеров и активацию (запуск) соответствующих ферментов (процессов).

Предложено несколько схем взаимодействия КМ с ионами кальция и исполнительной системой (ферментом). Одна из них, схема C.Huang, приведена ниже.

Согласно этой модели первая стадия - взаимодействие первого иона кальция с КМ ведет к конформационным изменениям молекулы, вследствие чего облегчается (увеличивается сродс­тво) присоединения второго иона. Связывание второго иона обуславливает выраженный конформационный переход молекулы и резкое (70-кратное) увеличение сродства комплекса Са-КМ к ферменту - исполнителю. Образование такого четвертичного комплекса, обладающего низкой ферментативной активностью, еще больше (в 150 раз) повышает сродство третьего и четвер­того связывающих участков к ионам кальция, координирование в которых последних переводит комплекс в активное состояние.

Выявлен ряд веществ, способных ингибировать КМ-зависи­мые реакции. В настоящее время список так называемых "низко­аффинных" ингибиторов (К_d= 1-10 мкМ) включает более 50 наи­менований. Из всего многообразия этих фармакологических агентов можно выделить две группы соединений, наиболее часто использующихся в экспериментальной практике, - препараты фе­нотиазинового ряда и производные нафталенсульфоната.

Производные фенотиазина были первыми соединениями, для которых установлена способность угнетать КМ-зависимые про­цессы. В присутствии ионов кальция с КМ связываются две молекулы трифторперазина с K_d= 1-1,5 мкМ и вызывают структурные изменения молекулы белка: увеличивается полярность участков, приближенных к раствори­телю, повышается подвижность сорбированного катиона и сродство КМ к ионам кальция. Механизм ингибирующего действия производных фенотиазина обусловлен связыванием с гидрофобными участками КМ, экспони­рующимися при взаимодействии белка с ионами кальция, и нару­шением его гидрофобных взаимодействий с исполнительной сис­темой. Вместе с тем, не исключается и участие электростатических взаимодействий молекул ингибиторов с КМ.

Механизм ингибирующего действия производных нафтален­сульфоната, из которых наибольшее распространение получило соединение W-7, также связан с нарушением гидрофобных взаи­модействий между комплексом Са-КМ и белком-исполнителем.

В последние годы для исследования кальмодулин-зависимых процессов широко применяется антибиотик R24571 (кальмидозо­лиум), который обладает наибольшей эффективностью (K_d= 0,5 мкМ) среди перечисленных антагонстов КМ. Следует также отметить, что кальмодулин-зависимые реакции угнетаются и ря­дом соединений, которые традиционно используются для воз­действия на другие регуляторные системы. Среди них антагонисты входа ионов кальция, блокаторы a- и b- ад­ренэргических рецепторов, местные анестетики, цитостатики, некоторые физиологически ак­тивные пептиды и т.п.

5.3 Сигнальная система, связанная с метаболизмом мембранных фосфоинозитидов.

Во многих клетках увеличению внутриклеточной концентрации ионов кальция предшествует активация фосфолипазы С. Фосфолипаза С может быть активирована вследствие взаимодействия агонистов с рецепторами, ассоциированными либо с ГТФ-связывающими белками, либо с тирозинкиназой. Фосфолипаза С осуществляет гидролиз фосфатидилинозитол 4,5-бисфосфата до инозитол1,4,5-трифосфата (ИФ₃) и диацилглицерола (ДАГ). ИФ₃ диффундирует в цитоплазму к ЭПР, связывается с соответствующим рецептором и вызывает открывание кальциевых каналов и выход ионов кальция в цитозоль клетки. ДАГ вместе с ионами кальция активирует специфическую протеинкиназу – кальций-фосфолипид-зависимую протеникиназу (протеинкиназу С) (рис. 31).

Протеинкиназа С фосфорилирует многие белки по остаткам серина и треонина, вызывая разнообразные биологические эффекты. Примерами таковых могут служить секреция, сокращение гладкомышечных клеток, агрегация тромбоцитов и др.

Протеинкиназа С (ПК-С) была обнаружена во многих тканях. В состоянии покоя она присутствует в клетке в основном в неактивной, растворенной в цитоплазме форме. Аго­нист-стмулированное образование ДГ, который вследствие своей гидрофобности накапливается в мембране, индуцирует переход ПК-С в активную, тесно связанную с мембраной форму. Эффект ДГ состоит в повышении сродства ПК С для ионов кальция, так что фермент может быть активирован без ка­ких-либо изменений уровня цитоплазматического кальция. В условиях in vitro ПК-С обладает широкой субстратной специфичностью и фосфорилирует сериловые и трео­ниловые (но не тирозиловые) остатки многих мембранных и ци­топлазматических белков.

Активность ПК-С не зависит от кальмодулина, но многие агенты, которые известны как антагонисты КМ, ингибируют фермент. В их число входят такие вещества, как трифторперазин, хлорпромазин, кальмидозолиум и соединение W-7. Ингибирующее влияние на ПК-С оказывают флуфе­назин, галоперидол, хлопротиксен, имипрамин, местные анесте­тики (дибукаин и тетракин), верапамил, фентоламин, адриами­цин, гепарин, полимиксин В, витамин Е. Ингибирую­щее влияние этих агентов не обусловлено их взаимодействием с активным центром ПК-С: каталитически активный фрагмент фер­мента, полученный при ограниченном протеолизе, не чувствите­лен ни к одному из них. Кинетический анализ свидетельствует, что эти вещества конкурентно ингибируют связывание ПК-С с фосфолипидами и не влияют на взаимодействие с ионами кальция или ДГ. Обладая высоким сродством к фосфатдилсерину и фосфа­тидилэтаноламину, они ингибируют ПК-С, модифицируя гидрофобные взаимодействия между ферментом и фосфолипидами.

Большой прогресс в изучении роли ПК-С в регуляции кле­точных функций был достигнут благодаря использованию форбо­ловых эфиров.

Форболовые эфиры (ФЭ), промоторы опухолей, способны за­мещать ДГ и прямо активировать ПК-С в присутствии ионов кальция и фосфатидилсерина. Эти соединения, подобно ДГ, повышают сродство фермента к кофакторам. Форболовый эфир, ТФА (12-0-тетрадеканоил-13-форболацетат) полностью ак­тивирует ПК С при концентрации ионов кальция 0,1 мкМ. Для активации ПК-С присутствие фосфатидилсерина обязательно, но другие фосфолипиды могут проявлять с ним по­ложительную (фосфатидилэтаноламин) или отрицательную (фосфа­тидилхолин, сфингомиелин) кооперативность.

В отличие от ДГ, транзиторно образующегося в мембране и быстро деградирующего, ФЭ, встраиваясь в мембрану, действуют длительное время, так как дитерпены метаболизируются очень медленно.

Активация ПК-С во многих тканях изменяет состояние ион­транспортирующих систем, модулирует чувствительность молеку­лярных механизмов к другим вторичным мессенджерам, модифици­рует мембранные рецепторы, изменяет активность метаболичес­ких процессов.

 

В настоящем разделе пособия нами рассмотрены различные пути внутриклеточной сигнализации. Следует заметить, что в одной и той же клетке присутствуют различные сигнальные системы. Таким образом, изменение активности клетки – результат сложных взаимоотношений между собой сигнальных путей, имеющихся в данной клетке.