Методы экспресс-диагностики инфекционных болезней
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - основана на амплификации (увеличения кол-ва копий)специфического гена возбудителя. Для этого двухнитевую ДНК вырезают из исследуемого материала, денатурируют и достраивают (при охлаждении) к расплетенным нитям ДНК новые комплиментарные нити. В результате данных операций из одного гена образуется 2. Этот процесс многократно повторяется при заданных температурных режимах до образования нужного количества копий необходимого гена. Иммуноферментный анализ (ИФА). В основе метода лежит выявление антигенов с помощью соответствующих им антител, коньюгированных с ферментом-меткой. Специфический антиген адсорбируют на поверхности лунок в пластинках из полимерного материала, фиксированный на пластинке антиген инкубируют с испытуемыми человеческими сыворотками. После отмывания от несвязавшихся белков связанные иммобилизированными антигенами Ig выявляют с помощью антивидовой иммуноблоттинговой сыворотки, антителам которой прикреплён фермент (пероксидаза). После инкубации с субстратом и индикотором (диаминобензидином) оценивают ферментативную активность по интенсивности окраски. Реакция иммунофлюоресценции (РИФ, метод Кунса) Различают разновидности методов: 1.Прямой – основан на том, что антигены тканей или микробов способны светиться под УФ-излучением после обработки иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами. Бактерии в мазке после обработки такой люминесцентной сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зелёного цвета. 2.Непрямой метод РИФ заключается в выявлении комплекса антиген-антитело с помощью антиглобулиновой сыворотки, меченной флюорохромом. Для этого мазки из взвеси микробов обрабатывают антителами антимикробной кроличьей диагностической сыворотки. Затем, антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой сывороткой, меченной флюорохромами. Радиоиммунный анализ (РИА) Высокочувствительный метод, основанный на реакции антиген-антитело с применением антигенов или антител, меченных радионуклидом. После их взаимодействия отделяют образовавшийся радиоактивный иммунный комплекс и определяют его радиоактивность в соответствующем счетчике: интенсивность излучения прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител. Иммуноблоттинг – высокочувствительный метод, основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИФ. Используют, как метод диагностики при ВИЧ. Антигены возбудителя разделяют с помощь электрофореза в геле, затем переносят их из геля на активированную бумагу и проявляют с помощью ИФА. Выпускаются такие полоски с «блотами» антигенов. На эту полоску наносят сыворотку больного, затем, после инкубации, отмывают и наносят сыворотку против Ig человека, меченную ферментом. Образовавшийся на полоске комплекс выявляют добавлением хромогенного субстрата, изменяющего окраску под действием фермента. Реакции иммобилизации (трепонем, холерных вибрионов) применяется при диагностике заболеваний, возбудителем которых являются подвижные бактерии. Для этого материал, взятый у больного обрабатывают специфическими сыворотками – если реакция положительнанаблюдается иммобилизация бактерий на стекле. Газожидкостная хроматография (ГЖХ) Этот метод является высокоэффективным методом обнаружения анаэробных бактерий, которые в процессе своей жизнедеятельности выделяют летучие жирные кислоты (изомасляная, масляная, валериановая, изовалериановая, капроновая). Для проведения этого анализа проводят экстракцию ЛЖК летучим органическим растворителем, после чего полученный экстракт вводят в хроматограф.
|
