Регуляция биосинтеза белка

Живые клетки имеют точно запрограмированные механизмы, регулирующие синтез различных белков таким образом, что в любой клетке присутствует определенное количество молекул каждого белка, позволяющее ей осуществлять свои метаболические процессы плавно и с максимальной эффективностью.

Процесс биосинтеза белка может регулироваться на уровне транскрипции и трансляции. У прокариот эта регуляции осуществляется преимущественно на уровне транскрипции.

Согласно теории Ф.Жакоба и Ж.Моно в биосинтезе белков у бактерий участвуют структурные гены, ген-оператор и ген-регулятор. Структурные гены определяют первичную структуру белков. Функционирование структурных генов контролируется геном-оператором. Процесс транскрипции начинается с промотора. Деятельность оперона находится под контролирующим влиянием другого участка ДНК, получившего название гена-регулятора. Структурные гены и ген-регулятор связаны специфическим белком – репрессором. Образование репрессора происходит в рибосомах на матрице специфической мРНК, синтезированной на гене-регуляторе. Репрессор имеет сродство к гену-оператору и обратимо соединяется с ним в комплекс. Если репрессор связан с геном-оператором, то РНК-полимераза не может синтезировать мРНК и, следовательно, белки. Если ген-оператор свободен, процесс транскрипции возможен и информация структурных генов используется для синтеза белков. Освобождение репрессора от гена-оператора происходит при его связывании с определенными низкомолекулярными веществами, называемыми индукторами, или эффекторами. В качестве индукторов часто выступают субстраты реакций.

В некоторых случаях молекулы репрессора не обладают способностью подавлять деятельность гена-оператора, но приобретают такую способность после образования комплекса с конечным или одним из конечных продуктов биосинтетического процесса. Конечный продукт выступает в качестве корепрессора.

Оценим характеристики биосинтеза белков в клетках кишечной палочки (E. сoli). Для удвоения числа клеток за 40 мин при 37 ºС требуется синтез примерно 1000 полипептидов со средней молекулярной массой 40 кДа за секунду. Эти полипептиды локализуются в минимальном объеме цитоплазмы менее, чем 1мкм³. Общая концентрация макромолекул в цитозоле клеток E. сoli достигает 340 г/л (напомним, что в сыворотке крови человека концентрация общего белка не превышает 85 г/л). Таким образом, синтезированная полипептидная цепь оказывается в пространстве, заполненном белками и другими макромолекулами при наличии протеолитических ферментов, способных ее гидролизовать. Возможны три негативных варианта судьбы полипептидной цепи: 1) протеолитическая деградация; 2) преципитация со снижением растворимости белка и 3) неправильное складывание полипептидной цепи. Все вышесказанное позволяет утверждать, что в процессе эволюции должны были отобраться механизмы, способные 1) сформировать правильную третичную (нативную) структуру белковой молекулы и 2) гидролизовать белки с неправильной конформацией полипептидной цепи. Для реализации таких механизмов используются белки шапероны, которые относятся к белкам теплового шока (hsp60, hsp70, hsp90, hsp100). Свое название эти белки получили потому, что их синтез возрастает при повышении температуры и других формах стресса. Параллельно они выполняют функцию защиты белков клетки от денатурации. Шапероны участвуют в трех процессах: 1) hsp60, hsp70, hsp90 определяют зависимое от АТФ правильное формирование третичной структуры белковой молекулы; 2) hsp70 и hsp100 определяют процессы агрегации-дезаггрегации полипептидных цепей и 3) hsp70 обеспечивает разрушение неправильных полипептидов после мечения их убиквитином в протеасомах (Consalvi V., Chiaraluce R., 2002).

Регуляция синтеза белков в клетках эукариот намного сложнее: не характерна прямая субстратная регуляция, т.к. опероны (транскриптоны) у эукариот имеют обширные регуляторные зоны; у эукариот структурные гены разбросаны по геному; в ядрах дифференцированных клеток эукариот большинство генов находится в репрессированном состоянии.

Выявлена оптимальная последовательность нуклеотидов (последовательность Kozak) для инициации трансляции: ЦЦ(А/Г)ЦЦА АУГ Г у высших эукариот: между пуриновыми нуклеотидными остатками А/Г и инициирующим кодоном АУГ необходимы три нуклеотидных остатка ЦЦА, а после инициирующего кодона – обязательно должен быть Г (гуаниловый нуклертидный остаток). Завершение трансляции более эффективно, если за терминирующими кодонами будут следовать остатки пуриновых нуклеотидов.

Препараты, влиящие на синтез белка, широко используются в практике. Индукторы применяются с целью стимуляции синтеза белка в поврежденных или ослабленных длительным бездействием (атрофичных) органах. Ингибиторы синтеза белка применяются в противоположных целях: для подавления деления и роста клеток.

Препараты, усиливающие биосинтез белков, относятся к так называемым анаболическим средствам. Анаболические средства бывают гормональные и негормональные. Наиболее выраженной способностью к индукции синтеза белка из гормонов обладают анаболические стероиды (производные мужских половых гормонов), которые сипользуются для только для стимуляции биосинтеза белков и нуклеиновых кислот в организме. Анаболической активностью обладает инсулин, который активирует синтез белка на уровне трансляции.

К негормональным анаболическим средствам относятся предшественники нуклеотидов и нуклеиновых кислот. Например, оротат калия (стимуляция синтеза пиримидиновых нуклеотидов), инозин. Данные препараты используются в качестве структурного материала и служит индуктором синтеза белка.

Ингибиторы синтеза белка делятся на ингибиторы: 1) транскрипции; 2) процессинга и транспорта РНК и 3) трансляции.

Ингибиторы транскрипции по механизму делятся на три группы: 1) ингибиторы РНК-полимераз; 2) вещества, связывающиеся с матрицей ДНК и нарушающие работу РНК-полимеразы и 3) структурные аналоги нуклеотидов, включающиеся в мРНК. Препаратом 1-й группы является α-аманитин (яд бледной поганки), избирательно ингибирующий РНК-полимеразу III (ответственную за транскрипцию мРНК); рифампицин, ингибирующий ядрышковую РНК-полимеразу I (отвечает за транскрипцию рРНК) и обратную транскриптазу.

Ко второй группе относятся актиномицин D (используется в биохимических исследованиях), антибиотики оливомицин, дактиномицин и растительные алкалоиды винбластин и винкристин, которые применяются в медицине как противоопухолевые препарты.

К третьей группе относится, например, 5-фторурацил, включающийся в мРНК вместо природного нуклеотида и приводящий в негодность синтезируемую матрицу РНК.

Ингибиторы процессинга и транспорта РНК. К ним относятся ингибиторы внутриядерных РНКаз, РНК-лигаз, осуществляющих различные фазы созревания РНК. Препятствует присоединению полиаденилового фрагмента к мРНК кордицепин.

Ингибиторы трансляции. К ним относятся антибиотики, применяемые как антибактериальные препараты.

Хлорамфеникол действует на 70S рибосомы и рибосомы митохондрий и хлоропластов эукариот. Хлормафеникол связывается с 50S субчастицей рибосом и блокирует пептидилтрансферазную реакцию, вызывая преждевременный обрыв синтезируемой полипептидной цепи.

Линкомицин действует на 80S рибосомы.

Эритромицин (и другие макролиды) ингибирует транслокацию пептидил-тРНК из участка А в Р-участок 50S субъединицы бактериальных рибосом.

Тетрациклины блокируют связывание мРНК и аминоацил-тРНК с малой субъединицей рибосом, т.е. фазу инициации и элонгации синтеза белка в рибосомах.

Стрептомицин влияет на 70S рибосомы бактерий и не оказывает действия на 80S рибосомы. Специфически связывается с белком малой субъединицы и нарушает правильное считывание мРНК.

 

13.5. Генная инженерия: технология рекомбинантных ДНК

Технология рекомбинантных ДНК – это совокупность экспериментальных процедур, позволяющая осуществлять перенос генетического материала (ДНК) из одного организма в другой.