Москва 2012
Цели работы. Приборы и принадлежности. Цель настоящей работы состоит в практическом овладении методом количественного флуориметрического анализа и приемами количественной оценки величин квантовых выходом фотохимических реакций в биологически значимых молекулах на примере триптофана в свободном состоянии и в составе белка.
Приборы и принадлежности:
План проделанной работы. 1. Подготовительная работа с теоретическим материалом. 2. Изучение принципа работы с приборами. 3. Регистрация концентрационных зависимостей Jф для свободного триптофана и бычьего сывороточного альбумина (БСА) в водных растворах. 4. Определение квантовых выходов фотолиза свободного триптофана в водном растворе и триптофановых остатков в составе молекулы бычьего сывороточного альбумина. 5. Подсчет и обработка результатов, с помощью программы Excel. 6. Написание выводов и отчета по проделанной лабораторной работе и полученным результатам.
Теоретическое введение. Флуориметрический анализ весьма широко используется для количественного определения содержания веществ, способных к флуоресценции. Метод основан на регистрации собственного (первичного) или вторичного излучения света исследуемыми молекулами. Для того, чтобы можно было определить количество флуорофора (испускающего флуоресценцию вещества) в объекте, необходимо знать, как зависит интенсивность его флуоресценции от концентрации. эта зависимость имеет следующий вид:
где Jф – интенсивность флуоресценции исследуемого вещества; J0 – интенсивность падающего на образец возбуждающего света; k – коэффициент, отражающий чувствительность флуориметра, q – квантовый выход флуоресценции (доля поглощенных квантов, которые излучаются в виде квантов флуоресценции); e - молярный коэффициент поглощения флуорофора на длине волны возбуждающего света, с – молярная концентрация флуорофора в объекте, l –длина оптического пути. Произведение e с l = D, оптической плотности объекта, обусловленной флуорофором. При малых концентрациях (и, следовательно, оптических плотностях) исследуемого флуорофора эта формула упрощается:
В общем случае зависимость Jф нелинейна (носит экспоненциальный характер). Линейная зависимость между концентрацией флуорофора в объекте и интенсивностью флуоресценции выполняется в очень ограниченных пределах оптической плотности, причем эти пределы для данного конкретного флуорофора, как правило, заранее неизвестны. Поэтому при решении количественной флуориметрической задачи измеряются калибровочные зависимости (Jф=f(c)) с использованием чистых растворов определяемого вещества с известной концентрацией, которые затем и используются для определения количества флуорофора в объекте. В биологических объектах очень часто имеют место явления, очень сильно влияющие на измеряемую величину Jф. Это экранировка возбуждающего света, реабсорбция флуоресценции, ее тушение, светорассеивание и неоднородное распределение исследуемого соединения по объему объекта. Применяется 3 основные схемы регистрации Jф, различающиеся углом между направлениями падения возбуждающего света J0 на объект, и регистрации квантов флуоресценции. Этот угол может быть (1) тупым; (2) 900; (3) 00 Регистрируемый фотосигнал при измерении флуоресценции будет складываться из собственно Jф, и квантов так называемого паразитного света.
Паразитный (или «рассеянный») свет складывается из следующих компонентов: (1) части излучения источника возбуждающего света в области флуоресценции исследуемого вещества, проходящей через монохроматор из-за его неидеальности; (2) света, возникающего из-за комбинационного рассеивания возбуждающего излучения (так называемый «красный спутник»; если излучение рассеивается молекулами воды, то это излучение смещено на 20-50 нм в длинноволновую сторону относительно длины волны возбуждающего света); (3) люминесценции кюветы и растворителя. Влияние на результаты флуориметрии компоненты (1) паразитного света будет особенно велико при угле между направлениями возбуждения и регистрации флуоресценции, равном 0о (схема 3 на рис. 1, называется также «регистрацией флуоресценции в проходящем свете»). Поэтому такая схема измерения Jф применяется очень редко. При применении схем (1) и (2) на рис. 1 влияние паразитного света будет значительно только при сильном светорассеивании в исследуемом объекте.
Эффект экранировки возбуждающего света наблюдается в тех случаях, когда в объекте, помимо исследуемого флуорофора, содержатся и другие вещества, способные поглощать возбуждающий свет. Для того, чтобы избежать этого, определяется поправочный коэффициент на экранировку возбуждающего излучения, dэ, с помощью которого затем корректируются измеренные величины Jф:
где Jф – интенсивность флуоресценции с поправкой на экранировку; Jф’ – измеренная интенсивность флуоресценции, D – оптическая плотность исследуемого флуорофора в объекте, а Dэ – суммарная оптическая плотность всех содержащихся в нем экранирующих возбуждающее излучение примесей.
Эффект реабсорбции квантов флуоресценции состоит в повторном поглощении этих квантов другими молекулами, присутствующими в объекте. Для получения истинной величины Jф измеренные значения интенсивности флуоресценции умножают на соответствующий dр. Собственно же dр определяется на каждой из длин волн по формуле:
Обозначения в этой формуле те же, что и формуле для расчета dэ, только Dэ заменено на Dp – суммарную оптическую плотность всех реабсорбирующих флуоресценцию соединений.
Миграцией энергии называется безизлучательный перенос энергии электронного возбуждения с одной молекулы (донора) на другую (акцептор) на расстояния, превышающие межатомные, и не связанный с соударением молекул. Для устранения миграции следует тем или иным способом увеличить расстояние между донором и акцептором – вероятность миграции энергии обратно пропорциональна этому расстоянию в 6-й степени.
Тушение флуоресценции – снижение величины Jф за счет падения q, вызванного воздействием молекул-тушителей.
Светорассеивание в мутных образцах также влияет на величину Jф.
Кинетический метод измерения квантового выхода фотохимических реакций
В основе практически всех фотобиологических процессов лежат фотохимические реакции в биологически значимых молекулах. При фотобиологических исследования часто бывает необходимо выяснить, насколько эффективно идет тот или иной фотохимический процесс в изучаемом объекте. Главной характеристикой эффективности индукции фотохимической реакции под действием излучения в той или иной молекуле является квантовый выход данной фотохимической реакции. Обозначим этот показатель j. По определению, j будет равен:
Или, что то же самое:
Для определения величины j наиболее удобно применять так называемый кинетический метод. Суть приема состоит в том, что тем или иным образом исследуется зависимость от дозы излучения либо количества исходных (неразрушенных) молекул, либо количество молекул продукта исследуемой фотохимической реакции. Этот метод применим при соблюдении следующих граничных условий:
Если оба эти условия соблюдены, то вид дозовой зависимости количества исходного соединения в образце будет описываться формулой:
где N – количество молекул неразрушенного вещества в образце, облученном в дозе Е, а s - так называемое поперечное сечение фотолиза, которое есть произведение j на r (r - поперечное сечение поглощения молекул фотолизируемого соединения, численно r =3,8´10-21 e), N0 – количество молекул вещества в исходном (необлученном) образце.
Если мы прологарифмируем обе части выражения (1), то получим следующий вид его представления:
Из уравнения (2) следует, что зависимость натурального логарифма отношения концентраций исследуемого вещества в образце после облучения в некоторой дозе Е (N) к его концентрации до начала облучения (N0) от дозы облучения Е носит линейный характер, причем коэффициентом пропорциональности служит величина поперечного сечения фотолиза. На практике тем или иным образом анализируется зависимость N=f(E), на основании полученных данных строится зависимость согласно уравнению (2), по этой зависимости определяется величина s, а затем по ее величине рассчитывается j, который равен:
Рис 1. Концентрационные зависимости интенсивности флуоресценции для триптофана в водном растворе. По оси ординат - интенсивность флуоресценции триптофана. По оси абсцисс - конечная концентрация триптофана в образце мг/мл При концентрациях 0 мг/мл- 0,04 мг/мл график имеет линейную зависимость, при концентрации триптофана в образце 0,04 мг/мл мы измеряем фотолиз.
Рис 2. Концентрационные зависимости интенсивности флуоресценции для БСА (бычий сывороточный альбумин) в водном растворе. По оси ординат - интенсивность флуоресценции БСА. По оси абсцисс - конечная концентрация БСА в образце мг/мл При концентрации от 0-0,3 мг/мл график имеет линейную зависимость при концентрации БСА в образце 0,5 мг/мл мы измеряем фотолиз.
Рис 3. Дозовые зависимости интенсивности флуоресценции триптофана в водном растворе. По оси абсцисс- доза излучения* 1019, по оси ординат- ln (Jфлобл¤Jфл0), Jфлобл - интенсивность флуоресценции раствора триптофана, облученный в разное время, Jфл0- интенсивность флуоресценции раствора триптофана необлученного.
Квантовый выход для триптофана j= 0,00083= 0,083%
Рис 4. Дозовые зависимости интенсивности флуоресценции БСА в растворе. По оси абсцисс- доза излучения* 1019, по оси ординат - ln (Jфлобл¤Jфл0), Jфлобл - интенсивность флуоресценции раствора триптофана, облученный в разное время, Jфл0- интенсивность флуоресценции раствора триптофана необлученного.
Квантовый выход для БСА j=0,11%
В ходе лабораторной работы познакомились с методом флуориметрии. После обработки экспериментальных дынных можно сделать следующие выводы: 1. При концентрации триптофана в пробе от 0-0,3 мг/мл зависимость Jф=f(c) сохраняет относительную линейность. 2. При концентрации БСА в пробе от 0 мг/мл- 0,04 мг/млзависимость Jф=f(c) сохраняет относительную линейность. 3. Квантовый выход свободного триптофана в водном растворе равен 0,083% и квантовый выход триптофановых остатков в составе молекул сывороточного альбумина равен 0,11%. 4. Квантовые выходы БСА и триптофана различаются потому, что чет я хз че написать, точнее я понимаю почему но красивые фразы чет в голову не лезут… если че завтра придумаем.
|
