Технологія виготовлення інсуліну в Україні та за її межами

Контрольна робота

з дисципліни: «Наукові основи безвідходних технологій»

 

Виконала:

студентка групи ЗТМя-6М

Капись Ю. В.

 

Київ 2013

Інсулін (від лат. іnsula – острів) – це гормон пептидної природи, що утворюється в бета-клітинах острівців Лангерганса підшлункової залози (острівці Лангерганса – скупчення гормон-продукуючих клітин, переважно в хвості підшлункової залози). Впливає на багато аспектів обміну речовин практично у всіх тканинах. Основна дія інсуліну полягає в зниженні концентрації глюкози в крові. Інсулін збільшує проникність плазматичних мембран для глюкози, активує ключеві ферменти гліколізу, стимулює перетворення в печінці і м’язах глюкози на глікоген, підсилює синтез жирів і білків. Крім того, інсулін пригнічує активність ферментів, що розщеплюють глікоген і жири. Тобто, крім анаболічної дії, інсулін володіє також і антикатаболічним ефектом. Порушення секреції інсуліну унаслідок деструкції бета-клітин – абсолютна недостатність інсуліну – є ключовою ланкою патогенезу цукрового діабету 1-го типу. Порушення дії інсуліну на тканини – відносна інсулінова недостатність – має важливе місце в розвитку діабету 2-го типу. Інсулін – це невеликий білок молекулярною масою 5,8 кДа. Він складається із двох поліпептидних ланцюгів: А (21 амінокислота) та В (30 амінокислот). Молекула інсуліну містить три дисульфідні зв'язки: два із них сполучають між собою A та B-ланцюги, а третій розташований всередині A-ланцюга. Основна фізіологічна дія інсуліну полягає у зниженні вмісту глюкози в крові, проте вона не обмежується цим, гормон також впливає на метаболізм білків та ліпідів. Одним із визначальних ефектів інсуліну є те, що він стимулює посилення засвоєння глюкози м'язами та жировою тканиною, проте не впливає на цей процес у печінці, нирках та мозку, клітини яких можуть транспортувати глюкозу навіть за відсутності гормональної стимуляції. Також інсулін блокує ті метаболічні шляхи, кінцевим продуктом яких є глюкоза, зокрема глюконеогенез та розщеплення глікогену, і стимулює ті, в яких вона використовується. Перший пріоритет при цьому належить задоволенню енергетичних потреб, зокрема протіканню гліколізу, кінцевим продуктом якого є піруват, та подальшого окиснення пірувату до ацетил-коА, який може бути використаний у циклі трикарбонових кислот. Залишок глюкози використовується на поповнення запасів глікогену у печінці та м'язах. У печінці інсулін також стимулює синтез жирних кислот із ацетил-коА, необхідний для цього НАДФH виробляється у пентозофосфатному шляху. Далі жирні кислоти у формі тригліцеридів транспортуються до жирової тканини. Інсулін також впливає на метаболізм опосередковано через головний мозок. Він впливає на ядра гіпоталамуса таким чином, що пригнічує споживання їжі та посилює термогенез. У м’язовій тканині інсулін стимулює захоплення амінокислот і синтез білків. Залишок амінокислот перетворюється у печінці до пірувату та ацетил-коА і використовується для синтезу жирів. Поглинання калію клітинами також активується під впливом інсуліну. Тому його препарати разом із глюкозою використовують для тимчасового зниження гіперкальціємії у пацієнтів із нирковою недостатністю. Точний молекулярний механізм такої дії інсуліну не з’ясований, проте відомо, що він може активувати Na⁺/K⁺-АТФазу. До довготривалих ефектів інсуліну на організм належить прискорення росту, що відбувається завдяки його загальному анаболічному та білок-заощаджувальному впливу. Тому у дітей з цукровим діабетом 1-го типу спостерігається затримка росту. Інсулін може стимулювати ріст незрілих гіпофізектомічних щурів, майже з такою ж інтенсивністю як і гормон росту за умови, якщо вони вживають велику кількість вуглеводів. Також відомо, що в культурі клітин інсулін пришвидшує клітинний поділ, схоже до пептидних факторів росту, таких фактор росту епідермісу, фактор росту фібробластів та тромбоцитарний фактор росту, і, окрім того, може посилювати їхній біологічний вплив.

Препаративне одержання інсуліну для лікувальних потреб – це одне із найбільших досягнень медицини XX століття. Розпочалось воно у 1921 році і зв’язано з іменами двох науковців Торонтійського (Канада) університету Фредериком Бантінгом та Чарльзом Вестом, які назавжди ввійшли до історії світової медицини. Після цього полковник Елі Ліллі, тодішній власник невеликої лабораторії для виготовлення медичних препаратів, у 1922 році заснував разом із Торонтійським університетом кооператив для виготовлення інсуліну. В тому ж році вперше у світовій медичній практиці 14-літній Леонард Томпсон, хворий діабетом, зберіг життя через лікування інсуліном, хоч іще не достатньо очищеним. Фірма Ліллі приступила до інтенсивного збільшення промислового виробництва інсуліну з підшлункових залоз тварин, і вже у 1925 році Ліллі-інсуліном лікувалося понад ЗО тисяч пацієнтів. Однак без забезпечення інсуліном велика кількість діабетиків помирали. Подальше вдосконалення методів одержання інсуліну фірмою Ліллі привело до одержання у 1968 році високоочищеного інсуліну з підшлункових залоз свиней, який відзначається високою ефективністю при лікуванні хворих діабетом. У 1980 році вперше вдалося виготовити біосинтетичним шляхом людський інсулін і врешті у 1983 році завдяки досягненням біотехнології було розроблено метод генно-інженерного одержання людських інсулінів. Тепер у багатьох країнах світу для лікування цукрового діабету застосовують як людські, так і високоочищені інсуліни з підшлункових залоз свиней. Майже кожен другий діабетик лікується тепер інсуліном фірми Ліллі. Конкурентна боротьба за ринки збуту інсуліну призвела до того, що у колишньому Радянському Союзі було припинено виробництво інсуліну, в тому числі в ендокринному цеху Львівського м’ясокомбінату, у якому виготовляли, за даними аналітичних служб, один із найкращих у Союзі інсулінів. Це було здійснено за розпорядженням міністра охорони здоров’я СРСР у 1990 році. Не виключено, що і для очищення ринку збуту іноземним фірмам. До речі, то був єдиний виробник інсуліну на Україні, на території якої проживає понад мільйон людей, хворих цукровим діабетом.

Станом на 1.01.2011 рік в Україні кількість зареєстрованих хворих на цукровий діабет (ЦД) сягнула більше 1 201 300 осіб, з яких - 4860 дітей та 3096 підлітків. У структурі ендокринних хвороб саме діабет займає друге місце (перше посіла патологія щитоподібної залози). Допомогти людям ураженим ЦД допомагає такий препарат як інсулін. Інсулін для щоденного введення використовують 189 058 людей. Виготовлення інсуліну є складним технологічним процесом. Не всі розвинені країни світу мають власне виробництво цього препарату. В світі існує всього чотири держави, які здійснюють повний цикл виробництва препаратів інсуліну.І Україна входить в цю четвірку. В Україні з 1999 року на київському заводі «Індар», який нині є одним з найбільших фармацевтичних підприємств на вітчизняному ринку, і виробляється інсулін. Український інсулін виготовляється на сучасному обладнанні, яке було свого часу поставлено такими відомими фірмами як «БОШ», «ГЛАТ- ЛІНДЕ», «СИМЕНС», «ЛЕТЦНЕР», «РОТА» та інші, при цьому використовувалась власна технологія. Виробництво потребує уважності та високої кваліфікації персоналу. До речі, виробництво препарату з 2004 року має (одне з перших серед фармпідприємств на Україні) Національний Сертифікат - НАЛЕЖНОЇ ВИРОБНИЧОЇ ПРАКТИКИ – GMP.

Технологічна схема виробництва інсуліну

Для виробництва інсуліну застосовують заморожену або свіжу підшлункову залозу переважно від великої рогатої худоби і свиней.

Подрібнення. Щоб уникнути руйнування гормону трипсином свіжі залози не пізніше ніж через 30 хв після забою тварини повинні бути очищені від прилеглих тканин, подрібнені на-м'ясорубці-дзизі.

Екстрагування. Подрібнені залози заливають підкисленим сірчаною кислотою 95° спиртом (на 1 частину залози-1,5 частини 95 ° спирту без альдегідів + 0,5% сірчаної або соляної кислоти). Суміш екстрагують при охолодженні протягом 1,5 год, постійно її помішуючи.

Перше витяг зливають, залишок віджимають або центрифугують. Віджим вдруге екстрагують 1 год 60 ° спиртом (а не 95 °, так як в сировині вже немає вологи) - на одну частину залози беруть одну частину спирту. Обидва витягу зливають разом і фільтрують через полотно.

Видалення баластних білків. З отриманого витягу білки видаляють різними способами:

1) відстоюванням на холоді (від -4 до 0 ° С) протягом 48 ч.

2) до витягання додають розчин їдкого натру до рН - 6,6 - 6,8 (у деяких випадках - до рН = 6,4 - 6,6).

Випав осад відокремлюють за допомогою центрифуги, фільтруванням або відстоюванням.

Упарювання і знежирення. Отриману прозору рідину підкислюють чистої сірчаної кислотою до рН = 2,5 і піддають упарювання до 1/10 обсягу при температурі не вище 40 ° С.Після видалення всього спирту рідина знежирюють.

Висолювання і очищення. До знежиреному фильтрату додають сульфат амонію до насичення, після чого інсулін з невеликою кількістю баластних речовин спливає, утворюючи кірку інсуліну-сирцю, яку знімають і сушать, а потім знежирюють спирто-ефірною сумішшю.

Знежирений висолів інсуліну висушують в кімнатних умовах і подрібнюють в порошок. Порошки висолів піддають подальшої очищенні для отримання кристалічного інсуліну, що містить не менше 22 ОД в 1 мг.

Стандартизація. Отриманий інсулін являє собою порошок білого або злегка сіруватого кольору. Він розчинний у воді і у водному розчині алкоголю до 80°, але не розчинний в алкоголі міцністю вище 90°. При розчиненні інсуліну у воді виходить або безбарвна, або злегка жовтувата рідина.

Для консервування до розчину додають 0,3% Трикрезол або фенолу і піддають його біологічної стандартизації. При упорскуванні інсуліну кроликам вміст вуглеводів у них в крові протягом від 1,5 'до 5 год повинно в середньому знижуватися на 50%, тобто від 0,09 до 0,045% (див. Фармакопею IX видання). Відповідну дозу називають однією кролячій одиницею, яка дорівнює трьом людським або трьом клінічним.

Розфасовка. Розчин пропускають через бактеріальний фільтр. Потім фільтрат розливають в асептичній обстановці у флакони по 5 або 10 мл в кожному мілілітрі розчину інсуліну повинно міститися по 40 або 80 ОД.

Флакони закривають гумовими пробками, які обкатують алюмінієвими ковпачками.На флакони і на коробку з флаконами наклеюють етикетки, на яких мають бути зазначені: активність препарату, дата виготовлення, термін зберігання і т.д.

Перед застосуванням інсуліну алюмінієвий ковпачок розкривають, протирають спиртом, потім стерильною голкою проколюють пробку і засмоктують у шприц необхідну кількість рідини, яку вводять підшкірно або внутрішньом'язово.

Зберігання. Зберігається інсулін у флаконах. Термін зберігання - 18 місяців при температурі не вище 10° С, тому що при більш високій температурі інсулін може частково втратити активність.

Зовнішні ознаки непридатності: помутніння розчину чи випадання осаду, поява усередині флаконів цвілі або колоній мікроорганізмів.

На сьогоднішній день «ІНДАР» - одне з небагатьох підприємств України, продукція якого відповідає новітньому світовому рівню завдяки широкому практичному використанню вітчизняних технологій, воно одним з перших вітчизняних підприємств отримало міжнародний сертифікат GMP, який засвідчує, що стан виробництва інсулінів відповідає стандартам Всесвітньої організації охорони здоров»я та нормативам Європейського союзу. Виробництво інсулінів на заводі здійснюється за повним технологічним циклом – від культивування продуценту протеїнового попередника інсуліну – до готових лікарських форм у флаконах та картриджах. На сьогодні понад 70% продукції «ІНДАРУ» поставляється на експорт. Активна експортна політика забезпечується значними інвестиціями в розробку нових біотехнологічних і фармакологічних препаратів, створення нових виробничих дільниць. У 2011-му році у розвиток заводу було інвестовано понад 10 млн доларів США. На заводі працює понад 400 спеціалістів різного профілю, є доктора та кандидати наук, адже «ІНДАР» приділяє багато уваги науковій та раціоналізаторській діяльності. Близько половини всіх інсулінозалежних в Україні використовують препарати «ІНДАРУ», ціна яких на 20-30 % нижча від ціни аналогових препаратів іноземного виробництва. За 11 років поставок інсулінів виробництва ЗАТ «ІНДАР» держава зекономила більше 250 млн грн. тільки за рахунок різниці цін на вітчизняний та зарубіжний інсулін. Стереотип щодо невідповідності встановленим стандартам якості інсулінів «ІНДАРУ» було розвіяно після того, як понад 220 тисяч інсулінозалежних у Бразилії перейшли на індарівський інсулін. При цьому ступінь алергічних реакцій склав 0,017% при допустимому показнику 2-3%. Клінічні випробування препаратів «ІНДАРУ» здійснювалися у провідних лабораторіях України, Росії, Казахстану, а отримані результати засвідчили забезпечення стану компенсації та субкомпенсації вуглеводного обміну або достовірне зниження глікемії при переводі пацієнтів на препарати «ІНДАРУ». Статистичний аналіз показав високу ефективність препаратів інсуліну «ІНДАРУ» у порівнянні із зарубіжними аналогами та хороше його перенесення, безпеку та повну відсутність побічних дій.

Виробництво інсуліну за межами України здійснюється фірмами «Авентіс» Німеччина, «Елі Ліллі» США, «Ново Нордіск» Данія. Зокрема, «Ново Нордіск» з 1945 року розпочинає випускати першу суміш інсуліну, виготовлену в заводських умовах. У 1946 році розробляє перший оригінальний ізофан-інсулін – інсулін подовженої дії, який дотепер залишається найрозповсюдженішим препаратом інсуліну у всьому світі. В 1982 році створено людський моно компонентний інсулін – перший у світі інсулін, ідентичний ендогенному інсуліну людини. Його отримали напівсинтетичним методом з підшлункової залози свиней. В 1999 році Ново Нордіск публікує перший соціальний звіт. В Європі представлена перша в світі система введення інсуліну з вмонтованою електронною пам’яттю Інново®. Впроваджено в клінічну практику НовоРапід® — перший інсуліновий аналог ультракороткої дії компанії Ново Нордіск. В 2001 році Ново Нордіск поділяється на три окремі компанії, які складають разом Ново Групп: Ново Нордіск А/Т, Новозаймс А/С и Ново А/С. Представлено першу систему для введення інсуліну, спеціально розроблену для пацієнтів з вадами зору і порушеною координацією — ІнноЛет®. Представлено перший в світі комбінований пристрій для вимірювання глюкози в крові і введення інсуліну — ІнДуо®. Створено пристрій для введення інсуліну ФлексПен® — нова одноразова шприц-ручка, попередньо заповнена в заводських умовах, яка вирізняється простотою в застосуванні й надійністю. В 2002 році Розроблено НовоМікс® 30 — двофазний аналог інсуліну. В 2009 році Ново Нордіск представив нове покоління шприц-ручки ФлексПен®. В Європейському Союзі представлено новий інноваційний препарат для лікування цукрового діабету 2-го типу: Віктоза® (Ліраглютід).

На сьогоднішній день препарати інсуліну часто підлягають фальсифікації, тому при прийомі препарату важливо робити все правильно і уважно прислуховуватись до реакції організму на ліки і ризик побічних ефектів зменшиться.