ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материал исследования

Дрозофила является адекватной моделью для изучения взаимосвязи сигнальных систем, запускаемых GDNF, и систем стрессорного ответа БТШ, ответственных за наличие в мозге тех или иных белковых отложений являющихся характерной чертой НДЗ различной этиологии. Использование животных моделей для понимания процессов нейродегенерации обусловливается тем, что практически невозможно получать образцы тканей на ранних стадиях НДЗ. Использование дрозофилы в качестве модели позволяет изучать механизмы функциональных нарушений на ранних стадиях и на различных образцах тканей. Кроме того, дрозофила имеет короткий жизненный цикл, и ее содержание относительно недорого. Поэтому в качестве материала исследования использовали следующие линии D. melanogaster:

Canton-S – линия дикого типа из США;

Berlin – линия дикого типа, выделена из природной популяции города Берлина. Широко используется при анализе поведения в Европе;

Oregon-R – линия дикого типа из природной популяции штата Орегон, США. На генетическом фоне этой линии дикого типа существуют многие известные линии-маркеры и балансеры;

agn^ts3 – мутантная линия, дефектная по синтезу LIMK1, ключевого фермента ремоделирования актина.

Воздействие тепловым шоком

Мух содержали при +25°С на стандартной изюмно-дрожжевой среде при свето-темновом цикле 12: 12. Тепловое воздействие на личинок D. melanogaster проводили в водяной бане GFL 1086 (GFL, Германия) при температуре +37°C в течение 30 минут. Воздействие проводили на стадии личинок III возраста. В каждом варианте эксперимента было использовано не менее шестнадцати особей. Фиксация происходила через 1 час после ТШ. В качестве контроля использовали интактных животных (без ТШ).

Иммунофлюоресцентный анализ распределения БТШ70

Исследование было проведено в Центре коллективного пользования «Конфокальная микроскопия» Института физиологии им. И.П. Павлова РАН.

Препараты анализировали при помощи лазерного сканирующего конфокального микроскопа Zeiss (иммерсионный объектив 63x).

Методика whole mount иммунофлюоресцентного окрашивания органов дрозофилы для конфокальной микроскопии позволила нам проследить локализацию БТШ70 в нервно-мышечных синапсах личинок данных линий.

Приготовление нейромышечных препаратов осуществляли на стадии личинок III возраста. Выделение контактов проводили в фосфатном буфере (PBS) на льду. Фиксировали в 4 % растворе параформальдегида в PBS в течение 20 мин. Отмывали фиксатор в РВS 3 раза по 1 минуте и 3 раза по 5 минут. Отмывали в PBT (PBS, 0.2% Tween 20, 0,2% Triton X-100) 3 раза по 1 минуте и три раза по 5 минут.

Инкубировали в 10 % блокировочной сыворотке (Normal donkey serum, Santa Cruz Biotechnology, USA) в PBT (pH = 7,5) в течение 1 часа при комнатной температуре.

В работе использовали первичные антитела (AT I) antibody 5A5 Mouse monoclonal to heat shock protein 70 (HSP70) (Abcam) и вторичные антитела (AT II) Atto 647 donkey anti-mouse (НПО "Биотехнологии") и флюоресцентные красители: FITC–конъюгированные anti-HRP–FITC–conjugated (Jackson Immuno Research) и DAPI (Carl Roth).

Инкубировали с AT I (разведение 1: 100) в 10 % блокировочной сыворотке, приготовленной на PBT, в течение суток при +4⁰С. Для лучшей проницаемости AT I в инкубационный раствор добавляли 1 % раствор DMSO. Препараты вынимали из холодильника и прогревали до комнатной температуры 1 час. Отмывали AT I в растворе PBT 3 раза по 1 минуте и 4 раза по 20 минут.

Инкубировали с AT II (разведение 1: 100) в 10 % блокировочной сыворотке, приготовленной на PBT, в течение 4 часов в темноте при комнатной температуре. Удаляли AT II и промывали в PBT 3 раза по 1 минуте и 4 раза по 10 минут. Отмывали в РBS 3 раза по 1 минуте и 2 раза по 15 минут.

Окраска ядер раствором DAPI (Roth, Германия) в PBS (рН = 7,5) осуществлялась в течение 40 минут при комнатной температуре. Использовали маточный раствор 100 мкМ, состоящий из 350 мкг DAPI в миллилитре дистиллированной воды. Рабочий раствор: 6,7 мкл маточного раствора DAPI и 1,9 мл PBS. Отмывали в PBS 3 раза по 1 минуте и 2 раза по 5 минут.

Заключали в 50 %-ный раствор глицерина на фосфатном буфере.