ПРОТЕОМНОЕ КАРТИРОВАНИЕ

«В мире не существует двух индивидуумов с абсолютно одинаковым метаболизмом. Индивидуальные различия активности ферментов в печени могут быть причиной различий в ответной реакции пациентов на лекарство" А Гаррод.

Важность этих слов, принадлежащих, сложно переоценить в свете последних достижений молекулярной медицины. Прочтение геномов ряда организмов, и прежде всего человека, ознаменовало начало эры постгеномных технологий. Существенное влияние они оказали на медицину, позволив систематически анализировать молекулярные механизмы зарождения и развития заболевания. Знание этих механизмов позволяет подойти к качественно новому пониманию вопросов, связанных с профилактикой, диагностикой и лечением заболеваний. Пожалуй, впервые за всю свою историю медицина получила шанс приблизиться к статусу точной науки, миновав описательную практику анализа патологических процессов, бытовавшую в течение столетий.

Протеомная карта заболевания – это понимание развития клинической картины заболевания в виде количественных и качественных нарушений на геномном, транскрипционном, трансляционном и посттрансялционном уровнях функционирования организма, т.е. на уровне нарушений в составе и взаимодействии генов в ДНК, РНК, белков, липидов, углеводов, а также на уровне образующихся в клетке и взаимодействующих между собой метаболитов.[3]

Важно подчеркнуть, что наличие подобных нарушений часто указывает лишь на вероятность развития патологии, следовательно можно, повлияв на факторы внешней среды, снизить вероятность развития заболевания, если провести соответствующие индивидуальные профилактические мероприятия.

Большинство заболеваний, таких как псориаз, шизофрения, диабет, обусловлены комбинацией малоэффективных генных вариантов, другими словами, обусловлены не единичным нарушениями, а их набором, локализованным в различных генах. При наличии четкой взаимосвязи между дефектом одного гена и развитием патологии можно говорить о ее наследственном характере. Однако на долю наследственных приходится лишь 2-5% всех заболеваний, остальные связаны с нарушением целого ансамбля генов, а значит, зависят от индивидуального профиля многих однонуклеотидных замен и/или нарушения экспрессии группы генов.

Протеомная диагностическая карта: включает SNP, ассоциированные с заболеваниями и SNP, ответственные за фармакокинетику и фармакодинамику лекарств, она формируется на основе знаний геномики, протеомики, липидомики, метаболомики, селломики, интерактомики и с применением современных методов полимеразной цепной реакции, хромато-масс-спектрометрии, современных видов микроскопии, микрофлюидных и нанотехнологических решений для аналитических работ.

Подобно тому, как сейчас гражданский паспорт служит документом, удостоверяющим личность, протеомная диагностическая карта, кроме идентификации личности, может предназначаться и для выбора индивидуумом соответствующего образа жизни. На его основе можно определять персонифицированное лечение, воплощая в жизнь золотой стандарт современной медицины: каждому больному - свое лекарство в нужное время и в нужной дозе.

Молекулярная (протеомная) диагностика является достоверным инструментом диагностики ранних стадий онкологических заболеваний и конкретно диагностики "молчащих раков", не проявляющих себя до тех пор, пока лечить его не станет поздно. Традиционные методики верификации рака подразумевают проведение биопсии, то есть забора микропорции ткани. Однако с точки зрения диагностики подход абсолютно неприемлем, поскольку трудно предположить человека, который в рамках плановой диспансеризации соглашается на манипуляции, по сложности и болезненности приближающиеся к хирургической операции. Значит, единственным наиболее доступным для диагностики биологическим образцом была и будет протеомное исследование крови.

В глобальном масштабе протеомика занимается инвентаризацией всех белков организма. Медицинский аспект проблемы - установить корреляцию между набором белков и началом или развитием болезни. Задача сходна с геномикой, где определяется зависимость между болезнью и геномом, но на порядок сложнее. Дело в том, что белков намного больше, чем генов. Число последних оценивается в 30-40 тыс., однако каждый ген может считываться во множестве (до 200) альтернативных вариантов, а значит, белков может быть значительно больше - до 6-8 млн. в одной клетке. Причем конкретный белок может быть экспрессирован как в виде единичных молекулярных копий, так и в огромном количестве - налицо широкий диапазон концентраций белков в клетке и биологических жидкостях. Можно возразить, что похожая ситуация складывается и при анализе ДНК, но в отличие от ДНК белки невозможно наработать в ходе полимеразной цепной реакции (ПЦР). А ведь именно ПЦР - основа всех методов работы с генетическим материалом, поскольку позволяет избирательно поднять концентрацию определенной молекулы ДНК до уровня, который может быть зарегистрирован приборами. Следовательно, методической основой протеомики является подход, при котором чувствительность приборов позволяет регистрировать отдельны молекулы. [5]

Существует международный проект "Протеом человека" (аналог проекта "Геном человека") который планирует конструирование протеомной карты всех белков человека. Первоочередные задачи проекта "Протеом человека" - составление протеомных карт плазмы крови, печени и мозга, а также проведение антигенного картирования генома. Кроме того, специальный комитет в составе проекта рассматривает новые технологические инициативы. Российский центр проекта принимает участие в разработке протеомной карты плазмы крови и печени, активно развивает новые подходы в области нанотехнологий.

Схема проведения протеомного анализа проста и основана на достижениях современной масс-спектрометрии. Образец, например плазма крови, отбирается у пациента в количестве чуть более 1 мл.. Очевидно, что в плазме крови присутствует множество различных белков. Разделение белков проводится методом двумерного электрофореза, и на двумерной электрофоре-грамме каждый белок предстает в виде отдельного пятна. Его интенсивность соответствует уровню экспрессии белка, то есть его количеству. Анализ гелей позволяет выявить индивидуальные вариации протеома, оценить статистические параметры для каждого пятна. Затем, сравнивая электрофореграмму с эталонными, удается выявить различия, связанные с заболеваниями. Различия заключаются в повышении или понижении экспрессии белка, некоторые белки появляются в плазме больных, тогда как другие могут исчезнуть. Однако на этапе анализа двумерных электрофореграмм речь на самом деле еще не идет о конкретных белках, а только об интенсивности пятен. Для того чтобы определить (идентифицировать) белок, пятно вырезают из геля, подвергают расщеплению, и массы фрагментов (пептидов) детектируют с помощью масс-спектрометрии.

Протеомный анализ сопряжен с проведением ряда трудоемких рутинных процедур, связанных с тем, что число анализируемых белков велико, а для статистической значимости результата требуется обработать большое количество образцов в соответствии со стандартным протоколом. Снятые масс-спектры передаются в программу идентификации белков. Профиль масс, полученный на масс-спектрометре, соответствующий пептидным фрагментам белка, позволяет однозначно его идентифицировать, проведя поиск соответствия с теоретическими профилями, построенными по белкам человеческого генома через специализированные компьютерные базы данных в сети Интернет в онлайн-режиме.

Постгеномная эра открывает широкие перспективы перед российскими учеными - в исследованиях по данному направлению сейчас участвует около десяти научно-исследовательских институтов РАН, РАМН, Минздрава России, Минпромнауки России и МГУ, которые располагают мощной аппаратной базой с квалифицированным техническим персоналом и значит есть потенциал для дальнейшего развития.

Для врача молекулярная карта заболевания – это ключ к точному диагнозу, прогнозу и целенаправленной терапии болезни.

Для исследователя молекулярная карта заболевания – базис для новыхоткрытий.

Рисунок 2 – Молекулярная (протеомная) карта и терапия человека