Студопедия Главная Случайная страница Обратная связь

Разделы: Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

РАБОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АМПЛИФИКАЦИОННЫХ ТЕХНОЛОГИЙ





 

1. Исследуемый материал может быть представлен чистыми культурами микроорганизмов, биологическим или секционным материалом от человека и животных, насекомыми, пищевыми продуктами, смывами с поверхностей, фильтратами почвы и т.д. (Прилож. 2).

2. Обработка исследуемого материала, инфицированного бактериями I - IV групп патогенности и возбудителями глубоких микозов.

2.1. Обработка исследуемого материала, инфицированного (подозрительного на инфицирование) микроорганизмами I - II групп патогенности (бактериями, не образующими споры, хламидиями, риккетсиями и возбудителями глубоких микозов), проводится следующим способом:

- к исследуемому образцу добавляют мертиолят натрия до конечной концентрации 1:10000 (0,01%) и прогревают его при 56 °С в течение 30 мин. Затем 100 мкл образца переносят в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, добавляют лизирующий раствор, приготовленный на основе 6 М гуанидинизотиоцианата в объеме, указанном в инструкции по применению к набору реагентов, и инкубируют 15 мин. при 65 °С. После выполнения данных процедур материал считается обеззараженным.

2.2. Обработка исследуемого материала, инфицированного (подозрительного на инфицирование) микроорганизмами III - IV групп патогенности (вирусами, хламидиями, риккетсиями и бактериями, не образующими споры), проводится одним из следующих способов:

2.2.1. Способ 1. Прогревание исследуемого образца при 100 °С в течение 30 мин.

2.2.2. Способ 2. К 100 мкл исследуемого образца добавляют лизирующий раствор, приготовленный на основе 6 М гуанидинизотиоцианата в объеме, указанном в инструкции по применению к набору реагентов (тест-системе), с последующей его инкубацией в течение 15 мин. при 65 °С.

После выполнения процедуры, указанной в п. п. 2.2.1 или 2.2.2, материал считается обеззараженным.

2.3. Обработка исследуемого материала, инфицированного (подозрительного на инфицирование) бактериями II - IV групп патогенности, образующими споры, проводится следующим способом:

- исследуемый материал в количестве 0,1 мл засевают в пробирки с 0,9 мл бульона Хоттингера, pH 7,2, и инкубируют с аэрацией при 37 °С в течение 2,5 ч. Добавляют пенициллин до конечной концентрации 1000 ед./мл и инкубируют при 37 °С в течение 15 мин. После инкубации с пенициллином исследуемый материал прогревают на водяной бане в течение 10 мин. при температуре 100 °С. Затем 100 мкл обработанного образца переносят в пробирки объемом 1,5 мл и добавляют лизирующий раствор, приготовленный на основе 6 М гуанидинтиоизоцианата в объеме, указанном в инструкции по применению к набору реагентов, и инкубируют 15 мин. при 65 °С. После выполнения данных процедур материал считается обеззараженным.

3. Обработка исследуемого материала, инфицированного вирусами I - II групп патогенности.

3.1. Обработка исследуемого материала, инфицированного вирусом натуральной оспы, проводится следующим способом:

- материал (100 мкл) помещают в пробирку объемом 1,5 мл, добавляют 400 мкл лизирующего буферного раствора, содержащего 100 мМ Трис-HCl (pH 8), 100 мМ ЭДТА, 100 мМ NaCl, 1% SDS и инкубируют 10 мин. при температуре 65 °С. Добавляют 50 мкл раствора протеиназы К (10 мг/мл), перемешивают и инкубируют в течение 1 ч при 56 °С. Центрифугируют в течение 5 мин. при 14000 об./мин. для осаждения нерастворенных частиц. Супернатант переносят в стерильные пробирки объемом 1,5 мл, добавляют равный объем смеси фенол/хлороформ (pH 8,0) и тщательно перемешивают. Затем центрифугируют в течение 5 мин. при 10000 g. Переносят верхнюю водную фазу, содержащую раствор фенола и ДНК, в новую пробирку, добавляют 1/10 по объему 3 М ацетата натрия (pH 5,5), 30 - 40 мкг РНК-носителя (1 мкл раствора РНК-носителя с концентрацией 30 - 40 мкг/мкл) и равный объем изопропанола. Затем центрифугируют в течение 15 мин. при 10000 g при 4 °С. Полученный осадок промывают добавлением 1 мл 70%-го этанола и центрифугированием в течение 5 мин. при 14000 об./мин. при 4 °С.

После выполнения данных процедур материал считается обеззараженным.

3.2. Обработка исследуемого материала, инфицированного вирусами I - II групп патогенности (кроме вируса оспы), содержащего инфекционную (позитивную) РНК, проводится следующим способом:

- материал (100 мкл) помещают в пробирку объемом 1,5 мл, добавляют 500 мкл лизирующего буфера на основе 6 М гуанидинизотиоцианата и фенола (1:1) и инкубируют 20 мин. при температуре 65 °С. Затем выделяют РНК, используя метод нуклеосорбции на силикагеле, начиная с этапа добавления сорбента, либо метод осаждения РНК этанолом в присутствии 0,3 М ацетата натрия. Обратную транскрипцию выполняют в соответствии с инструкцией по применению к набору реагентов. Затем в образцы с кДНК добавляют РНКазу А до конечной концентрации 25 мкг/мл. После выполнения данных процедур материал считается обеззараженным.

3.3. Обработка исследуемого материала, инфицированного (подозрительного на инфицирование) вирусами I - II групп патогенности, содержащих неинфекционную (негативную) РНК или ДНК, проводится следующим образом:

- материал (100 мкл) помещают в пробирку объемом 1,5 мл, добавляют 500 мкл лизирующего буфера на основе 6 М гуанидинизотиоцианата и фенола (1:1) и инкубируют 20 мин. при температуре 65 °С. После выполнения данных процедур материал считается обеззараженным.

3.4. Обработка исследуемого материала, подозрительного на инфицирование высокопатогенным неизвестным возбудителем, проводится в соответствии с п. п. 2.3 и (или) 3.1. Работа с таким материалом на всех этапах исследования осуществляется с применением специальных средств индивидуальной защиты согласно Прилож. 4.

4. В рабочие зоны 2, 3, 4-1 и 4-2 передаются только обработанные пробы, не содержащие инфекционный материал.

5. Обеззараживание остатков исследуемого материала в рабочей зоне 1 осуществляют в соответствии с СП 1.3.1285-03 и СП 1.3.2322-08.

 

Приложение 6

 







Дата добавления: 2015-09-18; просмотров: 303. Нарушение авторских прав; Мы поможем в написании вашей работы!

Studopedia.info - Студопедия - 2014-2022 год . (0.021 сек.) русская версия | украинская версия