Материалы и оборудование

Весы лабораторные, с наибольшим пределом взвешивания 200 г, сушильный шкаф; водяная баня; рН-метр; спектрофотометр; рефрактометр; роторный вакуумный испаритель; ферментатор, для глубинного культивирования микроорганизмов; центрифуга лабораторная; электрическая плитка; магнитная мешалка; штатив лабораторный; штатив для пробирок; воронка лабораторная диаметром 36 и 56 мм; воронка Бюхнера № 3,4; камера для тонкослойной хроматографии; колба Бунзена вместимостью 500 см³; колба мерная вместимостью 50, 100 и 1000 см³; цилиндр вместимостью 100 и 250 см3; колонка с ионообменной смолой ИА-1 и КУ-2; микрошприц МШ-10; пульверизатор; пипетка вместимостью 1, 2, 5 и 10 см³; бюретка вместимостью 25 см³; стакан химический вместимостью 50,100 и250 см³; стаканчик для взвешивания; пробирки химические; стеклянная палочка; пластинки для ТСХ Silufol (150 х 150); 0,2 н раствор гдроксида аммония; кальция гидроксид (оксид); 0,001 н раствор серной кислоты; смесь растворителей для ТСХ: н -пропанол – 25%-ный водный раствор гидроксида аммония (3:2); 70%-ный раствор; фосфорной кислоты; 1%-ный раствор нингидрина в ацетоне; 1%-ный раствор хлористоводородной кислоты; хлористоводородная кислота конц.; насыщенный раствор сульфата меди в 70%-ном растворе этилового спирта; набор стандартных АК; универсальная индикаторная бумага; фильтровальная бумага; вода дистиллированная; холодильник бытовой.

 

2.1. Предварительная обработка культуральной жидкости

На занятии используют культуральную жидкость, полученную при ферментации штаммов Corynebacterium glutamicum или Brevibacterium flavum в условиях периодического глубинного культивирования (подготовку питательной среды, посевных культур и ферментатора для биосинтеза глутаминовой кислоты студенты проводят непосредственно перед выполнением работы под руководством преподавателя).

Через пробоотборный штуцер ферментатора сливают в цилиндр 100 см³ культуральной жидкости и переносят её в термостойкий химический стакан. Затем отбирают пипеткой 1 см³ этого раствора в заранее приготовленную пробирку. Пробирку закрывают пробкой, нумеруют и ставят в штатив для последующего определения концентрации глутаминовой кислоты в исходном растворе.

Стакан с культуральной жидкостью помещают на нагретую до 80°С водяную баню. Через 5-10 мин к подогретому раствору добавляют 1,3 г Са(0Н)₂ (1 г СаО) и перемешивают раствор стеклянной палочкой. Нагревание раствора проводят в течение 10 мин. При этом микробные клетки и часть белков коагулируют. Далее, при перемешивании, добавляют из пипетки по каплям 0,7 см³ 70%-ного раствора Н₃Р0₄, что составляет примерно 1% от массы культуральной жидкости. Раствор после добавления ортофосфорной кислоты должен иметь значение рН 5-6. Значение рН раствора проверяют по показаниям рН-метра или с помощью универсальной индикаторной бумаги.

Стакан с полученной взвесью ставят на электрическую плитку и доводят его содержимое до кипения. Нагревание необходимо для ускорения реакции:

Са(0Н)₂ + CO(NH₂)₂ = СаСОз + 2NH₃,

а также для перевода карбоната кальция в фосфаты. При данном количестве добавляемой ортофосфорной кислоты образуется практически нерастворимый в воде Са₃(Р0₄)₂ и плохо растворимый СаНР0₄. Они осаждаются и увлекают за собой клетки бактерий и часть растворенных белков. Расслоение раствора по окончании операции свидетельствует о правильном проведении процесса.

2.2. Фильтрация культуральной жидкости

Полученную успензию фильтруют в горячем состоянии (с повышением температуры раствора уменьшается его вязкость и содержание растворенного гидрофосфата кальция) под вакуумом через бумажный фильтр с помощью воронки Бюхнера. Осадок на фильтре промывают 10 см³ дистиллированной воды и слегка отжимают с помощью стеклянной палочки. Измеряют объём фильтрата и отбирают в пробирку с помощью пипетки 1 см³ полученного раствора. Пробирку закрывают пробкой и оставляют на последующее определение содержания глутаминовой кислоты.

2.3. Выделение глутаминовой кислоты из фильтрата культуральной жидкости

Выделение глутаминовой кислоты из фильтрата культуральной жидкости проводят по двум вариантам: осветлением нативного раствора с помощью ионообменной смолы ИА-1 и сорбцией глутаминовой кислоты из нативного раствора ионообменной смолой КУ-2.

В зависимости от константы диссоциации иониты, как высокомолекулярные кислоты и основания разделяют:

-иониты (катиониты и аниониты), проявляющие свойства силь­ных кислот и оснований - сильнокислотные катиониты и сильноосновные аниониты;

-иониты (катиониты и аниониты), проявляющие свойства слабых кислот и оснований - слабокислотные катиониты и слабоосновные аниониты;

-иониты смешанного типа, проявляющие одновременно свойства сильной и слабой кислот или сильного и слабого основания.

Сильнокислотные катиониты характеризуются легкостью вытеснения из них ионов водорода другими катионами, что объясняется высокой степенью диссоциации поликислоты ионита. Они способны к обмену ионов при любом значении рН раствора. В качестве ионогенных групп сильнокислотные катиониты обычно содержат сульфогруппу -SO₃H, привитую к полистироловой матрице (КУ-2, КУ-2-8). Полистироловые катиониты в силу своей универсальности и большой химической стойкости применяются чаще, чем другие катиониты.

Сильноосновные аниониты способны к обмену ионов также при любых значениях рН раствора. В качестве фиксированных ионов они содержат -N⁺; -N⁺; -P⁺ группы. Сильноосновные аниониты имеют большую обменную ёмкость, хорошие кинетические показатели и легко регенерируются, но обладают низкой химической стойкостью, особенно в щелочных средах.

Слабокислотные катиониты участвуют в реакциях ионного обмена при рН>7. При рН раствора меньше 7 слабокислотные катиониты имеют незначительную обменную ёмкость. К слабокислотным относятся катиониты, к полимерной матрице которых привита карбоксильная группа -СООН. Для извлечения АК применяется одна из наиболее распространенных – карбоксильная смола КБ-4П-2. По сравнению с сульфокатионитами карбоксильные полиакриловые катиониты обладают значительно большей обменной емкостью, но уступают им по кинетическим характеристикам. Для карбоксильных катионитов характерно также повышенное сродство к Н⁺ ионам и в связи с этим регенерация их проходит намного легче и быстрее, чем регенерация сульфокатионов.

Слабоосновные аниониты способны к обмену ионов при рН<7. При рН>7 слабоосновные аниониты имеют малую емкость, т.е анионы кислот из растворов почти не сорбируют и не вытесняют гидроксил ионы. Фиксированными ионами их являются группы слабых оснований: первичные -NНз⁺, вторичные -NН₂⁺, третичные -NH⁺ аминогруппы.

Иониты смешанного типа обычно являются полифункциональными, содержащими ионогенные группы, характерные для слабокислотных и сильнокислотных катионитов или слабоосновных и сильноосновных анионитов. Такие иониты поэтому способны к обмену ионов в широком диапазоне значений рН раствора. В нашей стране для извлечения АК используется полифункциональный анионит ЭДЭ-10П, содержащий вторичные и третичные амины алифатического ряда, а также некоторое количество групп четвертичных аммониевых оснований. Он обладает большой обменной емкостью, химической стойкостью. Рабочий диапазон рН от 0 до 7-9.

Сорбенты, в том числе и ионообменные смолы, используют также, для удаления примесей из нативных растворов АК. Например, при производстве глутаминовой кислоты, а также высокоочищенных препаратов лизина применяется слабоосновной анионит ИА-1 (макропористая смола на основе резорцина и метафенилендиамина), сорбирующий преимущественно большие, полярные молекулы с гидрофобными участками.

Конкретные примеры использования ионного обмена и адсорбции для извлечения и очистки АК: осветление нативных растворов с помощью ионообменной смолы ИА-1 при культивировании микроорганизмов на мелассных средах (удаление пигментов); применение активированного угля при более глубокой степени очистки фильтратов; использование катионита КУ-2-8, КУ-2, КБ-4П-2 для извлечения из нативных растворов и получения высококонцентрированных препаратов лизина и триптофана, а также высокоочищенных препаратов лизина.

2.3.1. Осветление фильтрата культуральной жидкости анионитом ИА-1

Фильтрат культуральной жидкости подкисляют с помощью 1%-ного раствора хлористоводородной кислоты до значения рН 4,5-5,0 (при более низком значении рН раствора глутаминовая кислота кристаллизуется в осветляющей колонке, а при рН>6 снижается ёмкость осветляющей смолы по пигменту). рН раствора контролируют с помощью рН-метра или универсальной индикаторной бумаги.

Раствор подают в колонку со смолой сверху вниз с объёмной скоростью 1,5-1,7 ч^-1. Первые 15 см³ выходящего с колонки раствора сливают (вытесняемая вода). Затем начинается подача осветлённого раствора в сборник (стеклянный стаканчик). По окончании подачи раствора, его остатки вытесняют в тот же стакан 25 см³ дистиллированной воды (0,5 объёма смолы), подкисленной с помощью 1%-ного раствора хлористоводородной кислоты до значения рН 4,5-5,0.

Начало и окончание выхода осветленного раствора определяют по резкому изменению показателя преломления. Для этого отбирают стеклянной палочкой каплю раствора, вытекающего из колонки, и определяют показатель его преломления с помощью рефрактометра.

В результате проведенной очистки, нативный раствор на 95-97% освобождается от пигментов (для более глубокой очистки используют активированный уголь).

Осветленный раствор переливают в цилиндр и измеряют его объём. Отбирают пипеткой 1 см³ раствора и переносят его в пробирку. Пробирку закрывают пробкой, нумеруют и оставляют на последующий анализ.

2.3.2. Сорбция глутаминовой кислоты из фильтрата культуральной жидкости катионитом КУ-2

Глутаминовую кислоту выделяют из фильтрата культуральной жидкости сорбцией на смоле КУ-2 в NH₄⁺ - форме. Фильтрат подают в колонку со смолой сверху вниз с объёмной скоростью 1,5-1,7 ч^-1 (сорбционная емкость катионита составляет 0,08-0,1 г глутаминовой кислоты на 1 г абсолютно сухой смолы). По окончании подачираствора, колонку промывают 25 см³ 0,001 н раствором серной кислоты. После промывки колонки проводят элюирование глутаминовой кислоты 0,2 н раствором аммиака. Элюат собирают в стаканчик. Начало и конец элюирования определяют по изменению показателя преломления раствора, вытекающего из колонки. Элюат переливают в цилиндр и измеряют его объём. Отбирают пипеткой 1 см³ раствора и переносят его в пробирку. Пробирку закрывают пробкой, нумеруют и оставляют на последующий анализ.

2.4.Вакуум-выпаривание осветленного раствора (элюата)

Осветленный раствор (элюат) переливают в круглодонную колбу ёмкостью 500 см³ и выпаривают на роторном испарителе под вакуумом при температуре водяной бани не выше 50°С. Упаривание при более высокой температуре нежелательно, т.к. в этом случае помимо сахароаминной реакции (взаимодействие АК с углеводами), протекает реакция образования из глутаминовой пирролидонкарбоновой кислоты, что значительно снижает её выход. Периодически отгонку приостанавливают для определения показатель преломления раствора (он должен иметь значение 1,390-1,410). Осветленный раствор упаривают примерно в 4 раза до содержания сухих веществ 35%.

С помощью цилиндра измеряют объём упаренного раствора, отбирают пипеткой 1 см³ раствора и переносят его в пробирку. Пробирку закрывают пробкой, нумеруют и оставляют на последующий анализ.

2.5. Кристаллизация глутаминовой кислоты

Упаренный раствор переливают в стакан объёмом 50 см³ и помещают его на магнитную мешалку. Погружают в раствор электроды рН-метра таким образом, чтобы измерительный электрод был погружен в жидкость немного ниже вспомогательного и закрепляют их в штативе. После того, как показания рН-метра стабилизируются, к раствору приливают по каплям из бюретки концентрированный раствор хлористоводородной кислоты до установления рН 3,2. Стакан с раствором охлаждают на водяной бане со льдом до 5-10°С, а затем оставляют кристаллизоваться в холодильнике на 10-15 мин.

Выпавшие кристаллы глутаминовой кислоты отделяют от маточного раствора фильтрованием или центрифугированием при 9000 об./мин в течение 10-15 мин. Кристаллы промывают холодной дистиллированной водой в количестве 5% от массы маточного раствора и помещают в предварительно взвешенный стаканчик и доводят до постоянной массы в сушильном шкафу при температуре 60-70°С (их используют для последующих лабораторных работ).

С помощью цилиндра и измеряют объём фильтрата (фугата) и отбирают пипеткой 1 см³ в пробирку для последующего определения потерь глутаминовой кислоты на стадии кристаллизации.

2.6. Определение содержания глутаминовой кислоты в рабочих растворах

Определение проводят с использованием метода тонкослойной хроматографии. Хроматограммы проявляют нингидрином, элюируют окрашенные пятна и фотометрически определяют концентрацию глутаминовой кислоты.

Содержание глутаминовой кислоты в растворах устанавливают по калибровочному графику, построенному по стандартным растворам этой АК. Для построения калибровочного графика готовят серию растворов, содержащих: 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0 г/дм³ глутаминовой кислоты.

Пробы стандартных растворов с помощью микрошприца наносят на пластинки для ТСХ Silufol. Для этого на расстоянии 1,5 см от края пластинки проводят карандашом стартовую линию так, чтобы не нарушить слой сорбента. Образцы наносят в точки на расстоянии 2,5 см друг от друга и от края пластинки. Диаметр пятен не должен превышать 7-8 мм. Объём наносимой пробы – 10 мкл. После каждой пробы микрошприц промывают 2-3 раза дистиллированной водой.

После того как пятна подсохнут, пластинку помещают в хроматографическую камеру. Стенки камеры предварительно обкладывают фильтровальной бумагой для более быстрого насыщения её парами растворителя, а также для предупреждения образования «краевого» эффекта. Разделение проводят в системе растворителей: н -пропанол: 25% водный раствор аммиака (3:2).

Когда фронт растворителя дойдёт до верхнего края пластинки, её вынимают из камеры, высушивают на воздухе и затем опрыскивают из пульвелизатора 1%-ным раствором нингидрина в ацетоне (раствор должен смочить слой силикагеля равномерно, так, чтобы на пластинке не оставалось сухих участков).

Пластинку подсушивают в вытяжном шкафу и помещают на 15 мин в сушильный шкаф нагретый до температуры 50°С. При этом на хроматограмме появляются ярко окрашенные сине-фиолетовые пятна (сине-фиолетовый Руэмана). Измеряют относительное время удерживания (Rf) глутаминовой кислоты (отношение расстояния между центром пятна и стартом к расстоянию между фронтом растворителя и стартом).

Далее вырезают с пластинок окрашенные пятна, соответствующие глутаминовой кислоте, не строго по границе, а с небольшим запасом. С края пластинки вырезают контрольные участки, равные по размеру опытным. Вырезанные пятна измельчают ножницами и помещают в пробирки, содержащие по 5 мл насыщенного раствора CuSO₄ в 70%-ном этиловом спирте. Закрывают пробирки резиновыми пробками и оставляют на 45 ми­н в темноте, периодически перемешивая их содержимое.

Затем измеряют оптическую плотность растворов на спектрофотометре в кювете с толщиной слоя 10 мм при 535 нм. В качестве раствора сравнения используют растворы с контрольными участками хроматографической пластинки.

По полученным данным строят калибровочный график, откладывая на оси абсцисс концентрацию глутаминовой кислоты в стандартных растворах, а на оси ординат – их оптическую плотность. Определение содержания глутаминовой кислоты в рабочих растворах проводят по вышеизложенной методике.

При ТСХ-определении глутаминовой кислоты в рабочих растворах следует учитывать то обстоятельство, что концентрация её должна в растворах должна быть в пределах 1-5 г/л. Поэтому при необходимости растворы перед определением разбавляют.

Идентификацию пятен глутаминовой кислоты на хроматограммах рабочих растворов проводят по относительному времени удерживания глутаминовой кислоты стандартов.