Ход работы

Выделение глутаминовой кислоты из культуральной жидкости микробного продуцента

Методические рекомендации к лабораторным работам по общей биотехнологии

 

 

Специальность 240901

Биотехнология

 

 

Киров-2010

 

Общие положения

Основными промышленными способами получения аминокислот (АК) являются: экстракция из белковых гидролизатов животного и растительного происхождения (кератин, казеин, кормовые дрожжи, клейковина пшеницы, соевый шрот и т.д.); химический синтез; микробиологический синтез; комбинированные методы с применением иммобилизированных микробных клеток или ферментов, выделенных из микроорганизмов.

Из всех возможных способов получения АК микробиологическому синтезу отдается явное предпочтение как наиболее рентабельному. С его помощью получают около 60%всего объёма производимых АК. Это обусловлено, во-первых, его высокими технико-экономическими показателями по сравнению с другими способами, а, во-вторых, возможностью организовать в пределах одного предприятия производство как кормовых препаратов, так и особо чистых индивидуальных АК, пригодных к использованию в пищевой и медицинской промышленности.

И хотя организация процесса биосинтеза АК (особенно при использовании ауксотрофных мутантов) в производственных условиях довольно сложная задача, все же микробиологическое производство имеет ряд преимуществ: АК могут быть получены на основе простых и относительно дешёвых сырьевых материалах, таких как меласса, гидрол, кукурузный экстракт, глюкоза, уксусная кислота, углеводороды, спирты, сульфат аммония или мочевина и т.п. (несмотря на общее удорожание различных видов сырья, в том числе мелассы, она по-прежнему остается одним из основных сырьевых ресурсов современной промышленной микробиологии); АК образуется в биологически активной L-форме и в культуральной жидкости накапливается преимущественно одна АК, что значительно облегчает их последующее отделение и очистку; отсутствуют токсичные полупродукты синтеза.

К основным недостаткам микробиологического синтеза можно отнести следующее: необходимость ведения процесса выращивания продуцента и синтеза АК в стерильных условиях в течение длительного времени; многокомпонентный состав культуральной жидкости, содержащей целевой продукт в относительно небольших количествах.

В наиболее крупных масштабах выпускают L-глутаминовую кислоту – более 60% от всех производимых в мире АК. Это первая АК, полученная на основе промышленного микробиологического синтеза. Глутаминовая кислота не относится к числу незаменимых, однако на её основе осуществляется синтез многих физиологически активных соединений, необходимых для нормальной жизнедеятельности организма. В виде глутамата натрия (мононатриевая соль глутаминовой кислоты) её используют в пищевой промышленности для усиления вкусовых качеств продуктов питания и сохранения их в изделиях, предназначенных для длительного хранения, в частности в консервированном и замороженном состоянии.

В медицине глутаминовую кислоту применяют при лечении заболеваний, связанных с отравлением печени и почек, а также при лечении заболеваний центральной нервной системы (шизофрении, эпилепсии, психозов), язвы желудка, в послеоперационной терапии. Кроме того, её используют в косметике, а также при синтезе ряда полимеров (синтетической кожи, плёнок для упаковки пищевых материалов) и поверхностно-активных веществ.

В промышленности глутаминовую кислоту и на её основе глутамат натрия получают несколькими способами: многостадийным химическим синтезом из акрилонитрила, микробиологическим синтезом по одноступенчатой и двухступенчатой технологии, выделением из свекловичной мелассы или из белковых гидролизатов. Наибольшее распространение получили способы выделения глутаминовой кислоты из свекловичной мелассы и одноступенчатого микробиологического синтеза. Последний считается наиболее перспективным.

Принципиальная технологическая схема одноступенчатого микробиологического синтеза глутаминовой кислоты, как и любой АК, предполагает: получение посевного материала (размножение в несколько стадий исходной культуры продуцента на агаризованной среде, выращивание в маточных колбах, размножение культуры в системе инокуляторов и посевных аппаратов); приготовление питательной среды, её стерилизацию, охлаждение и засев готовым посевным материалом; выращивание продуцента в ферментаторе до накопления максимального количества продукта; стадию выделения целевой АК в кристаллическом виде; фасовку и упаковку готового продукта.

Поскольку в одноступенчатом способе производства АК используют среды, содержащие легкоусваиваемые источники углерода, азота и такие биологически активные вещества, как витамины, его организация возможна только в строго асептических условиях. При этом особое внимание обращается не только на стерилизацию используемых питательных сред и подаваемого воздуха, всего технологического оборудования и коммуникаций, но и на строжайшее соблюдение всех регламентных требований, обеспечивающих строго асептическое промышленное культивирование данного микроорганизма.

Продуцентами глутаминовой кислоты являются штаммы бактериальных культур Corynebacterium

glutamicum и Brevibacterium flavum. Кроме них промышленными продуцентами могут быть штаммы бактерий родов Microccocus и Microbacterium.

Для осуществления процесса биосинтеза глутаминовой кислоты с высоким выходом используют мутанты с нарушенной ферментативной системой превращения a -кетоглутаровой кислоты в янтарную. В нашей стране для биосинтеза глутаминовой кислоты используют ряд подобного рода культур, например Соrуn. glutamicum ВНИИ Генетика -490, Соrуn. glutamicum 541P, Brevibacterium sp.22 и др.

При промышленном культивировании в качестве источника углерода используют легкоассимилируемые углеводы (сахарозу и глюкозу), содержащиеся в свекловичной мелассе, гидроле, гидролизатах крахмала. Источником азота являются мочевина, реже хлорид и сульфат аммония, кукурузный экстракт, причём последний применяют только на стадиях получения посевного материала и инокулята, в основном по причине высокого содержания в нём биотина. Повышенное содержание биотина в мелассе также может ограничить использование её как основного источника сырья для биосинтеза.

Все продуценты глутаминовой кислоты биотинзависимые, а некоторые и тиаминзависимые, однако содержание биотина регламентировано и не должно превышать 2-5 мкг на 1 л среды. Более высокая концентрация биотина излишне стимулирует рост клеток продуцента, способствует повышенному образованию аланина, молочной, янтарной, аспарагиновой кислот, а выход глутаминовой кислоты при этом значительно снижается. Ингибирующее влияние биотина снижают включением в состав питательных сред различных добавок: некоторых насыщенных жирных кислот, антибиотиков (пенициллинов, тетрациклинов), детергентов. Добавки в среду твин-60 (0,15%) или дилудина (0,01%), или калиевой соли бензилпеницилллина (4-6 тыс. ед. на 1 л среды) повышают биосинтетическую способность продуцента на 15-45% и выход глутаминовой кислоты достигает 50 г/л.

Посевной материал на каждой стадии его получения (от пробирок до посевного аппарата) выращивают в строго асептических условиях по 24 ч. Состав питательных сред незначительно меняется при переходе от одного штамма к другому и практически остается постоянным на каждой из промежуточных стадий получения посевного материала. Только при выращивании в посевном аппарате в питательную среду вносят до 0,1% синтетического пеногасителя.

Для промышленных штаммов Соryn. glutamicum питательные среды при производстве посевного материала, как правило, содержат cледующие компоненты (%):

Меласса............................ 8,0 Сульфат магния..0,03

Кукурузный экстракт........... 0,3 MnS0₄*4Н₂О........ 0,001

Хлорид аммония................. 0,5 Вода............ остальное

Калия фосфат двухзамещенный..0,05 рН среды............ 7,0-7,2

Питательные среды на стадии биосинтеза содержат те же компоненты и в том же количестве, только вместо кукурузного экстракта и хлорида аммония присутствует до 2% мочевины, но вводится она дробно, по мере потребления её из среды, и, так чтобы содержание её в культуральной жидкости не превышало 0,8% (может использоваться водный раствор аммиака). Недостаток азота в среде снижает выход глутаминовой кислоты, способствуя накоплению повышенных количеств a -кетоглутаровой кислоты. Кроме того, увеличивают содержание мелассы до 20%, дополнительно вводят мел до 1% и 0,1% синтетического пеногасителя.

Накопление биомассы до 6-8 г АСВ на 1 л среды производят в аэробных условиях сначала в инокуляторах объемом 2 м³, затем в посевных аппаратах объемом 5 м³. Полученный посевной материал в количестве 5-6% (от объема среды производственных аппаратов) стерильно передают в основные ферментаторы. Процесс биосинтеза проводят в строго асептических условиях в ферментаторах объёмом 50 м³ с коэффициентом заполнения 0,7 в течение 48-52 ч и интенсивной аэрации (80-85 мг0₂/(л.мин), что соответствует расходу 1 объёма воздуха на 1 объём среды в 1 мин). Температуру культивирования поддерживают постоянной на уровне 28-30 °С, а рН среды 6,8-7,8. В конце процесса биосинтеза культуральная жидкость содержит до 45 г/л глутаминовой кислоты. Выход глутаминовой кислоты по отношению к потребленным сахарам – 45-50%.

Для выделения, очистки и концентрирования АК в настоящее время чаще всего используют ионный обмен, выпаривание, осаждение в изоэлектрической точке или при добавлении органических растворителей, кристаллизацию. Ведутся работы по использованию экстракции, электродиализа, обратного осмоса и ультрафильтрации. АК можно очистить удаляя их из раствора (ионный обмен, экстракция, электродиализ, осаждение и т.д.) или удаляя из раствора примеси (ионный обмен, адсорбция, ультрафильтрация, осаждение примесных ионов и т.д.). При получении высокоочищенных препаратов АК и культивировании продуцента на окрашенных средах используют оба способа выделения и очистки.

Технологическая схема выделения АК из культуральной жидкости строится с учётом как физико-химических свойств индивидуальных АК, так и их количества в среде и включает, как правило, следующие стадии: предварительную обработку культуральной жидкости, с целью улучшения фильтруемости; отделение клеток продуцента; очистку (осветление) нативного раствора от окрашенных примесей с использованием сорбционных методов; выделение целевой АК с помощью ионного обмена или методом осаждения; концентрирование элюатов или маточных растворов вакуум-выпаркой; перекристаллизацию технических кристаллов готового продукта из насыщенного раствора; вакуум-сушку очищенных кристаллов.

Наиболее просты схемы выделения глутаминовой кислоты и лизина, что объясняется их относительно высоким накоплением в культуральной среде и физико-химическими свойствами.

Поскольку производство глутаминовой кислоты направлено на получение высокоочищенных препаратов, подготовленных непосредственно к применению в качестве пищевых добавок и в виде лекарственных форм, выделение её из культуральной жидкости и последующая очистка в соответствии с требованиями фармакопеи предполагает следующую последовательность проведения технологических операций.

Предварительная обработка культуральной жидкости. Осуществляется добавлением к ней определённого количества негашеной извести (или известкового молока) с последующим осаждением избытка ионов кальция фосфорной кислотой. Образующийся при этом осадок способствует лучшему отделению клеток продуцента и других балластных примесей.

Отделение осадка. Проводят центрифугированием или фильтрованием под давлением.

Осветление фильтрата. Очитка его от пигментных примесей, окрашивающих нативный раствор в тёмный цвет с помощью ионообменной сорбции на анионите ИА-1 или обработки его активированным углем.

Концетрирование осветлённого раствора глутаминовой кислоты. Проводят путем вакуум - выпаривания при температуре 40-60°С, при этом из исходного раствора отгоняют от 50 до 80% воды.

Осаждение кристаллов глутаминовой кислоты в изоэлектрической точке. Эту стадию осуществляют путем подкисления концентрата соляной кислотой до рН 3,2 (растворимость глутаминовой кислоты в воде в изоэлектрической точке 1:150 при 20°С) и охлаждения раствора до 4-15°С. Однократное проведение операции обеспечивает кристаллизацию 77%глутаминовой кислоты; при повторном её проведении выход возрастает до 87%. Чистота полученных кристаллов достигает 88%.

В результате последующей перекристаллизации чистоту получаемых кристаллов можно увеличить до 99,6%, что удовлетворяет требованиям фармакопеи.

Отделение кристаллов глутаминовой кислоты от маточного раствора. Проводят центрифугированием с последующей декантацией и возвратом маточного раствора на стадию вакуум-выпаривания. Полученные кристаллы промывают обессоленной водой и направляют на сушку.

Сушка кристаллов глутаминовой кислоты. Проводят в вакууме или в токе нагретого воздуха при 60-70°С.

Получение глутамата натрия. Процесс осуществляется обработкой влажных кристаллов неперекристаллизованной глутаминовой кислоты гидроксидом натрия. Для этого влажные кристаллы растворяют в определенном количестве воды и нейтрализуют 45-50% раствором гидроксида натрия до рН раствора 6,8, после чего раствор фильтруют. Осветлённый раствор глутамата натрия упаривают под вакуумом до содержания сухих веществ около 60% и передают на кристаллизацию. Её проводят в течение трех суток при постепенном снижении температуры. Кристаллы глутамата натрия отделяют от маточного раствора центрифугированием и сушат в токе горячего воздуха. Глутамат натрия пищевой должен иметь следующий состав (%): основное вещество, не менее – 94; хлорид натрия, не более – 5; влага, не более – 1; общий азот, не менее – 7.

Ход работы

Цель занятия: ознакомление с технологией получения АК одноступенчатым микробиологическим синтезом и их выделения из культуральной жидкости; овладение лабораторными навыками по коагуляции, осветлению и кристаллизации АК с оценкой величины потерь и выхода продукта на стадиях выделения на примере глутаминовой кислоты.