Общие сведения. Тема: Возбудитель туляремииЛабораторная работа №10 Тема: Возбудитель туляремии
Цель занятия: Изучить морфологические, культуральные и биохимические свойства возбудителя туляремии, ознакомиться с методами микробиологической диагностики возбудителя и биопрепаратами. Оборудование и материалы. Туляремийный антиген для РА и позитивная сыворотка; готовые фиксированные мазки Francisella tularensis (туляремийный антиген для РА). Общие сведения Возбудитель туляремии относится к семейству Bracellaceae, роду Francisella. Francisella — распространены во многих пресноводных водоемах; могут паразитировать у человека, млекопитающих, птиц и членистоногих. Род представлен видами Francisella novicida (известен один уникальный штамм, выделенный из озерной воды в США) и Francisella tularensis (возбудитель туляремии - болезнь Фрэнсиса). Заболевание впервые описано японскими врачами (1837). До открытия Охарой (1925) новой бактерии, названной кокком Охары-Хагч, болезнь не связывали с конкретным возбудителем. Как возбудитель чумоподобной лихорадки земляных белок (Cytellus beechei) микроорганизм также выделили Маккой и Чепин (1911) в районе озера Туляре (графство Туляре, штат Калифорния). Позднее была установлена эпидемическая связь заболевания с кровососущими членистоногими (1924), лишь в 1928 г. Фрэнсис доказал идентичность туляремии и болезни Охары. Нозогеографически туляремия принадлежит к распространенным инфекциям, ее регистрируют повсеместно в Северном полушарии (исключая Англию) в ареале между 30° и 70° с. ш. На территории РФ впервые официально выделена данная культура С. Суворовым и др. в 1926 г (Астраханская область). Возбудитель дифференцируют на экологогеографические расы и варианты. Тип A (Nearctica) выделяют от многих грызунов и кровососущих насекомых; высоковирулентен для человека и кроликов; ферментирует глицерин, содержит цитруллинуреидазу. Тип распространен в Северной Америке; очень патогенен для человека. Тип В (Palaearctica) выделяют из воды и от водных животных; маловирулентен для человека и кроликов; не ферментирует глицерин, не содержит цитруллинуреидазу. Возбудитель регистрируют в Европе и Азии; не ферментирует глицерин, умеренно патогенен для домашних кроликов и человека, вариант japonica выделяют в Японии (ферментирует глицерин), вариант mediasiatica вызывает заболевания в Средней Азии в дельтах рек Или и Аму-Дарьи (ферментирует глицерин, содержит цитруллинуреидазу; умеренно патогенен для домашних кроликов и человека). Распространение. Francisella tulaiensis выделена от многих диких и домашних животных, а также птиц, рыб и земноводных. Основные источники заражения человека - обыкновенные полевки (Microtus arvalis), домовые мыши (Mus. musculus), водяные крысы (Arvicola tenestis), ондатры (Ondathra zibethica), а также зайцы, особенно русак (Lepus europeus) и беляк (L. timidus). Переносчики инфекции – кровососущие членистоногие: иксодовые и гамазовые клещи, блохи, слепни (оленьи мухи), комары, москиты. На юго-западе США бактерии выделяют из оленьих мух; на северо-западе - из лесных клещей. На востоке США возможными источниками инфекции для человека считают белок-летяг (Ptemmyidae). Человек заражается от больных животных, кровососущих членистоногих или объектов внешней среды. Пути заражения: контактный (через кожу и слизистую оболочку глаз), инокулятивный (при укусе переносчика), алиментарный (через ЖКТ) и аспирационный (через дыхательные пути). Патогенез. После проникновения возбудителя в организм его дальнейшее распространение происходит, как правило, с током лимфы и реже через кровоток, куда он попадает позднее, (что создает угрозу генерализации). Фагоциты активно поглощают Francisella tularensis, но они не способны к их внутриклеточному киллингу, что создает предпосылки для депонирования бактерий в лимфатических узлах. Часть возбудителей при этом погибает, что сопровождается выделением эндотоксина, действующего на узел и окружающие ткани. Таким образом, вслед за стадией лимфогенного заноса развивается стадия очаговых реакций, в результате чего формируются туляремийные бубоны. По аналогии с чумой человека последние разделяют на первичные (возникают метастатически лимфогенно и связаны с местом входных ворот) и вторичные, а также на бубоны первого порядка, второго и т.д., учитывая время их появления. Периодически из сформированных очагов возбудитель проникает в лимфо- и кровоток, что сопровождается выделением новых порций эндотоксина и сенсибилизацией (регистрируют кожными пробами). Прорывы бактерий могут приводить к метастазированию в печень, селезенку, легкие, костный мозг и другие органы, что обусловливает вторичные поражения (например, вторичную пневмонию, менингит и т.д.). Микроб малоустойчив к высоким температурам (при 100°С гибнет в течение 1-2 мин), но при температуре 0-4°С в воде и почве сохраняется от 4 до 9 мес; в шкурах павших грызунов при 8°С сохраняет жизнеспособен до 1 мес. 1.1 Туляремия - острая инфекционная болезнь животных и человека, характеризуется септическим течением, поражением лимфатических узлов (набухание, творожистое перерождение), селезенки, образованием множественных гранулематозно-некротических очажков в различных органах, лихорадкой и общей интоксикацией. Морфология (микроскопия). F. tularensis — мелкие (размером 0,1-0,5 мкм) неподвижные капсулированные грамотрицательные палочки с выраженным полиморфизмом (от кокковидных до нитевидных форм), особенно у неарктических видов. Споры не образует. В мазках из культур доминируют кокковидные формы, в мазках из органов - коккобактерии, которые возможно слабо воспринимают краситель и окрашиваются бледнее, чем прочие патогенные микроорганизмы, однако бактерии легко воспринимают краску Гимзы (окрашиваются в розово-голубой цвет); в чистой культуре могут окрашиваться биполярно. Размножаются почкованием. У авирулентных штаммов находят массированное подобие капсулы, у вирулентных - нестойкое слизистое вещество. Клеточная стенка имеет гладкие контуры. Материал для исследования. В лабораторию при жизни животного посылают пунктат из увеличенных (мягких) лимфоузлов, абортированный плод (или органы плода), мочу, фекалии; после гибели животного - печень, почку, селезенку, увеличенные лимфоузлы от крупных животных. Трупы грызунов и «других мелких животных направляют целиком. При необходимости патматериал консервируют в растворе глицерина или в смеси стерильного вазелинового масла с парафином (25мл:2,5мл). Следует учитывать, что обнаружить возбудитель туляремии в препаратах-отпечатках возможно лишь при обильном обсеменении исследуемого материала. Работа с кровью, мокротой или аспиратами лимфатических узлов больного связана с большим риском для сотрудников лаборатории и предъявляет особые требования к ее оснащению и квалификации персонала. Культуральные свойства. Облигатный аэроб. Температурный оптимум 36-37°С (пределы 54°С), оптимальный рН 6,7-7,4. Бактерии культивируют на сложных агаровых или желточных средах с добавлением тканевых экстрактов, цистеина, кроличьей дефибринированной крови и других питательных веществ. Включение в питательную среду полимиксина В или пенициллина подавляет рост других микроорганизмов. На обогащенных агаровых средах колонии F.tularensis мелкие, в виде капелек беловатого цвета с голубоватым отливом, круглые, с ровным краем, выпуклые и блестящие. При разреженном посеве через несколько суток достигают диаметра 2 мм и более, (рост становится заметным с 3-5 сут культивирования). Изолированные колонии удобно получать при посеве на среды О. Емельяновой или Мак-Коя; используют также агар с переваром сердечной мышцы, дополненный 5% крови барана или кролика. Колонии вирулентных штаммов по морфологии и биологическим свойствам соответствуют S-диссоциатам. На жидких средах размножаются хуже и только у поверхности среды, что связано, по-видимому, с аэрофильностью бактерий; более удовлетворительных результатов достигают аэрацией среды или внесением биоколлоидов (яичного желтка, агара и т.д.). Биохимические свойства выражены слабо. Ферментируют до кислоты глюкозу, мальтозу, левулезу и маннозу (американские, среднеазиатские и японские штаммы дополнительно и глицерин), но определить эту способность можно только на специальных средах с ограниченным содержанием белка и точно определенным рН. Имеют следующие ферменты: каталазу, глутаминазу, аспарагиназу, дез- и трансаминазу, цитруллинуреидазу. Индол не образуют, продуцируют аммиак и сероводород, редуцируют некоторые краски, например тионин, метиленовый синий, малахитовый зеленый. Лабораторная диагностика. Предположительный диагноз основывают на соответствующем анамнезе и клинических проявлениях. Наиболее достоверные результаты дает выделение Francisella tularensis (рисунок), однако культивирование возбудителя сопряжено не только с трудностями, но и с угрозой заражения персонала и разрешено только в лабораториях особо опасных инфекций.
|
