Хроматография

Хроматография - это метод разделения компонентов в динамических условиях, основанный на их различном распределении в подвижной и неподвижной фазе [28].

Неподвижная фаза может представлять собой твердом вещество с развитой поверхностью, либо неподвижную жидкость, удерживаемую на твердом носителе.

Подвижная фаза просачивается сквозь слой неподвижной фазы.

Критериев классификации хроматографических методов анализа много. Наиболее важные, отражающие физико-химическую сущность и особенности техники анализа следующие:

· агрегатное состояние разделяемых веществ - газ (пар) или жидкость (раствор);

· природа неподвижной фазы - твердое вещество или жидкость;

· техника выполнения анализа - в колонке, капилляре, на бумаге, в тонком слое сорбента.

· характер взаимодействия между неподвижной фазой (сорбентом) и разделяемыми веществами, иначе механизм, лежащий в основе разделения компонентов;

Классификация по последнему из перечисленных критериев является наиболее фундаментальной. Она включает группы методов, основанные на:

1. распределении молекул между двумя фазами (в том числе, макромолекул и коллоидных частиц);

2. распределении ионов между двумя фазами;

3. распределении веществ (ионов или молекул), сопровождающееся окислением или восстановлением в фазе (на поверхности) сорбента.

К первой группе относятся адсорбционная, распределительная, молекулярно-ситовая, афинная хроматография.

В адсорбционной хроматографии используется различие в относительном сродстве компонентов к твердому адсорбенту, взятому в качестве неподвижной фазы.

К методам адсорбционной хроматографии относятся:

· адсорбционная жидкостная хроматография (подвижная фаза - жидкость, проводится в колонке);

· адсорбционная тонкослойная хроматография (подвижная фаза - жидкость, техника проведения - плоскостная);

· адсорбционная газовая хроматография (подвижная фаза - газ, техника - колоночная).

В распределительной хроматографии используется различное относительное распределение (растворимость) веществ между подвижной и неподвижной жидкой фазой (растворителем), которая удерживается неподвижно на пористом инертном носителе.

Виды распределительной хроматографии:

· газожидкостная (подвижная фаза - газ, техника - колоночная);

· распределительная жидкостная (подвижная фаза - жидкость, техника - колоночная);

· хроматография на бумаге (подвижная фаза - жидкость, техника - плоскостная);

· распределительная тонкослойная (подвижная фаза - жидкость, техника плоскостная).

Молекулярно-ситовая (гель-проникающая, эксклюзионная) хроматография основана на диффузии молекул в поры сорбента. Подвижная фаза - жидкость, техника - колоночная. Элюент подбирается таким образом, чтобы снять возможные адсорбционные взаимодействия между разделяемыми компонентами и сорбентом (носителем).

Афинная хроматография основана на специфическом сродстве между одним из разделяемых компонентов и специфически связывающейся с ним молекулой (лигандом), «пришитой» к нерастворимой матрице (взаимодействие типа антитело-антиген).

Вторая группа методов представлена ионообменной, осадочной и комплексообразовательной хроматографией.

В ионообменной хроматографии разделение обусловлено различной способностью к обмену ионов хроматографируемого раствора на эквивалентное количество одноименно заряженных подвижных ионов (коионов) в составе ионита. Ионообменная хроматография реализуется в колоночном варианте, либо в плоскостном - ионообменная тонкослойная хроматография (неподвижная фаза - твердая, подвижная - жидкость).

Осадочная хроматография основана на обмене ионов с образованием малорастворимых соединений. На инертном носителе удерживаются химически активные вещества, образующие с компонентами смеси труднорастворимые осадки; разделение обусловлено последовательностью осаждения, зависящей от различия в растворимости выпадающих осадков (подвижная фаза - жидкость, техника - колоночная, либо плоскостная).

В адсорбционно-комплексообразовательнай хроматографии происходит образование координационных соединений в фазе (на поверхности сорбента). Носитель насыщен комплексообразующим органическим реагентом, разделение смеси металлов-комплексообразователей обусловлено различием величин констант неустойчивости их комплексных соединений с органическими реагентами (подвижная фаза - жидкость, техника - колоночная).

К третьей группе хроматографических методов относится окислительно-восстановительная хроматография. Но ситель удерживает вещество, участвующее в окислительно-восстановительном процессе с компонентами разделяемой смеси и химически инертное к носителю. Разделение обусловлено неодинаковыми скоростями окислительно-восстановительных реакций, протекающих между окислителем или восстановителем, содержащимся в колонке на носителе и компонентами хроматографируемой смеси. Скорость реакции зависит от различия величин окислительно-восстановительных потенциалов разделяемых компонентов.

Предел обнаружения хроматографических методах находится в интервале (10^-7 - 10^-4)%, а точность измерения - (2-20)%.

 

Хроматографический анализ включает следующие этапы:

1. Получение первичной хроматограммы - через слой сорбента пропускают порцию смеси разделяемых веществ. При этом, как правило, смесь полностью не разделяется.

2. Получение проявленной хроматограммы - для полного разделения веществ первичную хроматограмму промывают чистым растворителем. В результате различной сорбируемости компоненты анализируемой смеси передвигаются в слое адсорбента с различной скоростью, вследствие чего происходит образование зон отдельных компонентов и их постепенное раздвигание.

3. Извлечение веществ из фазы сорбента.

 

К методам проявления хроматограмм относятся: фронтальный анализ, элюентный анализ и вытеснительная хроматография:

· фронтальный анализ - колонку промывают чистым растворителем, затем в колонку вводят анализируемый раствор. На первой стадии пропускания раствора все разделяемые компоненты удерживаются адсорбентов и в первых порциях присутствует чистый растворитель. Затем появляется ступенька, отражающая проскок растворенного вещества. Объем растворителя, собранного до момента проскока, т.е. до появления первой ступеньки на выходной кривой, называется удерживаемым объемом. В чистом виде можно выделить только один, наименее адсорбирующийся компонент. По числу ступенек на хроматограмме судят о количестве компонентов в растворе.

· элюентный анализ - колонку промывают чистым растворителем, в колонку вводят небольшое количество анализируемого раствора; полученную первичную хроматограмму промывают чистым растворителем. На выходе из колонки появляются пики индивидуальных компонентов, разделенные чистым растворителем.

· вытеснительная хроматография - после пропускания разделяемой смеси в колонку подают раствор вещества, энергично десорбирующего ранее поглощенные компоненты разделяемой смеси. При непрерывной подаче раствора вытеснителя в колонке создается стационарный режим, при этом скорость перемещения всех зон оказывается постоянной и равной скорости движения фронта вытеснителя. В случае выпуклых изотерм адсорбции на выходе из колонки появляются ступеньки чистых компонентов. Высота каждой ступеньки не зависит от количества вещества в фильтрате, а определяется только природой вещества (изотермой адсорбции). Поэтому по высоте колонки можно отождествлять данный компонент. Так как площадь ступеньки пропорциональна количеству вещества и высота ступеньки постоянна (для данного компонента), то ширина ступеньки пропорциональна количеству вещества.

Хроматограмму характеризуют следующими критериями удерживания:

V_e - объем удерживания (элюции) - объем подвижной фазы, необходимый для элюирования данного вещества через слой неподвижной фазы;

V_o - свободный (внешний) объем колонки - объем, занимаемый подвижной фазой;

V_s - объем неподвижной фазы (в распределительной хроматографии), объем пор (в молекулярно-ситовой хроматографии), поверхность адсорбента (в адсорбционной хроматогафии), ионообменная емкость (в ионообменной хроматографии).

Критерии удерживания связаны соотношением:

 

V_e = V_o + КЧV_s,

где К - коэффициент распределения компонента, равный отношению концентраций вещества в неподвижной фазе и подвижной фазе.

Хроматографические методы используются в мониторинге ОПС не только для непосредственного анализа, но и для предварительного извлечения, либо концентрирования анализируемого вещества (для пробоподготовки).