Метод определения АОЕ по отношению к катион-радикалу АБТС

Метод измерения антиоксидантной ёмкости основан на реакции обесцвечивания катион-радикала АБТС в присутствии антиоксидантов, которые способны обрывать свободнорадикальные реакции окисления.

Метод состоит из четырёх этапов:

· экстракция липофильной фракции образцов (добавок или хлебобулочных изделий);

· экстракция гидрофильной фракции;

· анализ АОЕ липофильной фракции по отношению к катион-радикалу АБТС;

· анализ АОЕ гидрофильной фракции по отношению к катион-радикалу АБТС.

При анализе АОЕ хлебобулочных изделий использовали тщательно измельчённый до однородного состояния мякиш выпеченных проб.

Из измельчённых образцов экстрагировали липофильные антиоксиданты. Необходимая масса навеки хлебобулочных изделий для экстракции – 2 г. Навеску образца взвешивают в фалькон объёмом 50 мл и добавляют 30 мл смеси гексан-хлороформ. Полученную смесь перемешивали сначала на вортексе (V-3 Elmi, Латвия) в течение 1 мин, а затем на ротамиксе (RM-1M Elmi, Латвия) со скоростью 90 об./мин в течение 1 ч. Для отделения взвешенных частиц смесь центрифугировали при 3000 g и температуре + 4 ºС в течение 30 мин (центрифуга Eppendorf 5702 centrifuge). Надосадочную жидкость отделяли стеклянной пипеткой, а к осадку приливали ещё 30 мл смеси гексан-хлороформ. Далее проводили повторный цикл экстракции. Надосадочные жидкости, полученные после первой и второй экстракции, объединяли и упаривали досуха на роторном испарителе Hei-Vap Advantage HB/G3B (Heidolph, Германия) при температуре водяной бани 35 ºС. Полученный маслянистый остаток растворяли в 1 мл гексана и использовали для анализа АОЕ липофильной фракции.

Осадок, полученный после экстракции жирорастворимых антиоксидантов, подсушивают в потоке аргона для удаления органических растворителей. К высушенному осадку добавляют 25 мл смеси ацетон-вода-уксусная кислота. Полученную смесь тщательно перемешивали также как и при экстракции липофильной фракции: на вортексе (V-3 Elmi) в течение 1 мин, а затем на ротамиксе (RM-1M Elmi) со скоростью 90 об./мин в течение 1 ч. Смесь центрифугировали (Eppendorf 5702 centrifuge) при 3000 g и температуре + 4 ºС в течение 30 мин. Надосадочную жидкость отделяли стеклянной пипеткой в мерную колбу на 50 мл, а к осадку приливали ещё 25 мл смеси ацетон-вода-уксусная кислота. Далее проводили повторный цикл экстракции. Надосадочные жидкости, полученные после первой и второй экстракции, объединяли и доводили до 50 мл смесью ацетон-вода-уксусная кислота. Полученный раствор использовали для анализа АОЕ гидрофильной фракции. Непосредственно перед анализом раствор фильтровали через шприцевой фильтр с гидрофильной мембраной с порозностью 0,45 мкмоль (Sartorius, Германия).

Перед тем, как проводить измерение АОЕ, необходимо осуществить калибровку. Калибровка производилась по тролоксу – водорастворимому аналогу витамина Е, принятому при определении АОЕ за стандарт. Калибровку для липофильной фракции строили в диапазоне концентраций тролокса 20-200 мкмоль. Генерация катион-радикала АБТС производилась неферментативно с помощью пероксодисульфата калия. Для этого 7 мМ ABTS (диаммонийная соль 2-азинобис-(3-этилбензтиазолин)-6-сульфоновой кислоты) смешивали с 2,45 мМ пероксодисульфата калия и инкубировали в течение 16-18 ч в темноте. После инкубирования для определения АОЕ липофильной фракции образцов раствор катион-радикала АБТС разводили смесью гексан-этанол до оптической плотности 0,70 ± 0,02 при 734 нм и длине оптического пути 1 см. Измерение оптической плотности проводили на спектрофотометре Shimadzu UV-1601 PC (Япония). Реакционная смесь содержит 2 мл раствора катион-радикала АБТС и 100 мкл раствора тролокса. В контроль вносили 2 мл раствора катион-радикала АБТС и 100 мкл гексана. Раствор тролокса вносили в реакционную среду с помощью стеклянного микрошприца. Регистрировали убыль оптической плотности полученных растворов при длине волны 734 нм в течение 3 мин. Рассчитывали изменение оптической плотности раствора за 3 мин ΔD, равное разности начального значения оптической плотности (D₀) и достигаемого в ходе 3 мин реакции (D).

Калибровку для гидрофильной фракции строили в диапазоне концентраций тролокса 10-100 мкмоль. Генерация катион-радикала для АБТС производилась так же, как и для определения липофильной фракции. Для определения АОЕ гидрофильной фракции образцов раствор катион-радикала АБТС разводили 50 мМ фосфатно-солевым буфером (PBS) с pH = 7,4 до оптической плотности 0,70 ± 0,02 при 734 нм и длине оптического пути 1 см. Для измерения оптической плотности на спектрофотометре Shimadzu UV-1601 PC подготавливали реакционную смесь, содержащую 1,8 мл раствора катион-радикала АБТС и 200 мкл раствора тролокса. В контроль вносили 1,8 мл раствора катион-радикала АБТС и 200 мкл смеси ацетон-вода-уксусная кислота. Регистрировали убыль оптической плотности полученных растворов при длине волны 734 нм в течение 3 мин. Рассчитывали изменение оптической плотности раствора также как и для липофильной фракции.

Полученные экстракты липофильной фракции использовались для измерения АОЕ хлебобулочных изделий и добавок. Генерация катион-радикала АБТС производилась неферментативно с помощью пероксодисульфата калия. Для этого смешали 7 мМ ABTS с 2,45 мМ пероксодисульфата калия и инкубировали в течение 16-18 ч в темноте. После инкубирования для определения АОЕ липофильной фракции образцов раствор катион-радикала АБТС разводили смесью гексан-этанол до оптической плотности 0,70 ± 0,02 при 734 нм и длине оптического пути 1 см. Измерение оптической плотности проводили на спектрофотометре Shimadzu UV-1601 PC (Япония). Реакционная смесь содержала 2 мл раствора катион-радикала АБТС и 100 мкл экстракта анализируемой пробы. В контроль вносили 2 мл раствора катион-радикала АБТС и 100 мкл гексана. Регистрировали убыль оптической плотности полученных растворов при длине волны 734 нм в течение 3 мин. Рассчитывали изменение оптической плотности раствора за 3 мин ΔD, равное разности начального значения оптической плотности (D₀) и достигаемого в ходе 3 мин реакции (D). Расчёт АОЕ липофильной фракции производили по формуле:

где АОЕ – антиоксидантная ёмкость исследуемого образца, выраженная в мкмольолях тролоксового эквивалента / г сухого вещества (мкмоль ТЭ/г СВ);

DD_СР – среднее значение изменений оптической плотности одной пробы за 3 мин при длине волны 734 нм;

R – фактор разбавления;

V – объем экстракта, л; для липофильной фракции V = 0,001 л;

F – тангенс угла наклона калибровочной зависимости убыли оптической плотности раствора катион-радикала АБТС от концентрации тролокса в пробе для липофильной фракции, л/мкмоль;

m – масса навески исследуемого образца, г;

j – массовая доля влаги в исследуемом образце изделия.

Генерация катион-радикала для АБТС производилась также, как и для определения липофильной фракции. Для определения АОЕ гидрофильной фракции образцов раствор катион-радикала АБТС разводили 50 мМ фосфатно-солевым буфером (PBS) с pH = 7,4 до оптической плотности 0,70 ± 0,02 при 734 нм и длине оптического пути 1 см. Для измерения оптической плотности на спектрофотометре Shimadzu UV-1601 PC подготавливали реакционную смесь, содержащую 1,8 мл раствора катион-радикала АБТС и 200 мкл раствора тролокса. В контроль вносили 1,8 мл раствора катион-радикала АБТС и 200 мкл смеси ацетон-вода-уксусная кислота. Регистрировали убыль оптической плотности полученных растворов при длине волны 734 нм в течение 3 мин. Рассчитывали изменение оптической плотности раствора также как и для липофильной фракции. Далее осуществляли расчёт АОЕ (в мкмоль ТЭ/г СВ) гидрофильной фракции проб хлебобулочных изделий и добавок по формуле:

где DD_СР – среднее значение изменений оптической плотности одной пробы за 3 мин при длине волны 734 нм;

R – фактор разбавления;

V – объем экстракта, л; для гидрофильной фракции V = 0,05 л;

F – тангенс угла наклона калибровочной зависимости убыли оптической плотности раствора катион-радикала АБТС от концентрации тролокса в пробе, л/мкмоль для гидрофильной фракции;

m – масса навески исследуемого образца, г;

j – массовая доля влаги в исследуемом образце изделия.