Реакция иммунного лизиса

Антитела-лизины способны растворять микробы или другие клеточные элементы. Однако свое действие лизины могут проявлять только в присутствии комплемента. Для постановки реакции готовят ряд разведении инактивированной нагреванием сыворотки, затем добавляют живую микробную взвесь и комплемент. После инкубации в термостате реакцию оценивают с помощью повторных количественных высевов. В качестве контроля используют исследуемую культуру микробов, нормальную сыворотку и комплемент.

Феномен Исаева - Пфейффера. Реакцию иммунного лизиса ставят in vivo и употребляют обычно для лабораторной диагностики холеры. Смесь культуры микроба со специфической иммунной сывороткой вводят внутрибрюшинно морским свинкам. При соответствии выделенной культуры и иммунных антител происходит растворение микроорганизмов. Это можно установить микроскопией мазков, взятых из экссудата, или при посеве на агар (отсутствие роста).

 

 

Реакция связывания комплемента (РСК)

РСК широко используют для лабораторной диагностики венерических болезней, риккетсиозов, вирусных инфекций. Реакция протекает в две фазы. Первая фаза - взаимодействие антигена и антител при обязательном участии комплемента, вторая - выявление результатов реакции при помощи индикаторной гемолитической системы (эритроциты барана и гемолитическая сыворотка). Разрушение эритроцитов гемолитической сывороткой происходит только в случае присоединения к гемолитической системе комплемента. Если же комплемент адсорбировался ранее на комплексе антиген - антитело, то гемолиз эритроцитов не наступает.

При наличии в исследуемой сыворотке антител, комплементарных антигену, образующийся комплекс антиген - антитело связывает (адсорбирует) на себе комплемент. При добавлении гемолитической системы гемолиза не происходит, т.к. весь комплемент израсходован на специфическую связь комплекса антиген - антитело, а эритроциты остались неизменными.

При отсутствии в сыворотке антител, комплементарных антигену, специфический комплекс антиген - антитело не образуется и комплемент остается несвязанным. Поэтому при добавлении гемолитической системы комплемент присоединяется к ней. Результатом реакции в данном случае будет гемолиз эритроцитов - в пробирках образуется так называемая "лаковая" кровь.

Ввиду сложности реакции все компоненты, участвующие в ней, должны быть оттитрованы и взяты в реакцию в равных объемах.

Метод флюоресцирующих антител (МФА)

Данный метод является экспрессным и высокочувствительным. Существуют две его разновидности.

При прямом методе к исследуемой взвеси микробов, фиксированной на стекле, добавляют сыворотку, меченную флуорохромом (для этой цели используют обычно изотиоцианат флуоресцеина - ФИТЦ). Образующийся комплекс антиген - антитело при освещении ультрафиолетовыми (сине-фиолетовыми) лучами дает ярко-зеленое свечение.

При непрямом методе МФА используют обычные диагностические сыворотки против какого-либо вида микробов. Добавление этой сыворотки к испытуемой взвеси микробов вызывает образование комплекса антиген - антитело. Этот комплекс выявляется при помощи универсальной флюоресцирующей сыворотки, содержащей антитела к глобулиновой фракции крови того вида животного от которого была получена диагностическая сыворотка.

Для образования комплекса антиген - антитело препарат помещают во влажную камеру при 37°С, затем тщательно промывают дистиллированной или водопроводной водой от несвязавшихся антител. Светящийся комплекс выявляют при люминесцентной микроскопии.

Люминесцентная микроскопия позволяет не только удостоверить наличие микроорганизма и оценить его морфологию, но и выяснить, в каких клеточных структурах микроорганизм локализован, что чрезвычайно важно для клинической диагностики.

Непрямой МФА можно использовать и для выявления антител в сыворотке крови. Для этого на стекло наносят взвесь эталонного микроорганизма, после фиксации его на стекле и промывания наносят капли сыворотки крови в определенных разведениях. После промывки наслаивают люминесцирующую сыворотку против глобулиновой фракции сывороточных белков крови человека.

В последние годы в качестве флюоресцентной метки используют положительно заряженные ионы редкоземельных металлов - лантанидов (европий, самарий, тербий и др.), которые обладают гораздо более длительной флюоресценцией и большим стоксовским сдвигом. Все это позволяет снизить количество ложноположительных результатов.

Иммуноферментный анализ (ИФА)

В настоящее время ИФА является наиболее широко распространенным иммунологическим методом. Принцип ИФА аналогичен непрямому варианту МФА, но имеет ряд отличий:

1) антитела или антигены фиксируются не на стеклах, а на внутренней поверхности синтетических планшетов для иммунологических реакций;

2) в качестве метки используется не флюорохром, а фермент (пероксидаза, щелочная фосфатаза, уреаза и др.);

3) реакция учитывается не под микроскопом, а визуально, после добавления в лунку субстрата для данного фермента.

Для объективной оценки результатов ИФА используют специальные фотометры с вертикальным ходом лучей.

Радиоиммунный анализ (РИА)

Принцип анализа аналогичен ИФА, но в качестве метки используют не фермент, а радиоактивный изотоп.

Для определения антигенов и антител разработаны многочисленные варианты иммунологического анализа, которые предусматривают использование меченных различным образом реактивов.

Радиоактивное мечение изотопом 131J, а в последнее время все чаще 125J- многократно проверенный и надежный метод. Но реактивы нестабильны в результате радиоактивного распада и опасны для здоровья.

Иммунорадиометрическое определение антигена отличается от радиоиммунологического тем, что используются изотопы меченого реагента. Для определения антигена твердую поверхность, например пластиковую, нагружают антителами и добавляют исследуемый раствор. После отмывания количество антигена, связавшегося с пластиком, можно определить, добавляя избыток радиоактивно меченных антител. Специфичность метода повышается при использовании "твердофазных" и меченых антител, направленных к разным участкам антигена.

Антигены в сложной смеси могут быть идентифицированы методом иммуноблоттинга. Белки после разделения сложной их смеси методом электрофореза в полиакриламидном или агарозном геле можно перенести из геля на микропористую нитроцеллюлозную мембрану. Далее неспецифически связанные с мембраной антигены могут быть идентифицированы с помощью меченых антител. Если белки антисыворотки разделить изоэлектрофокусированием, а затем перенести (блоттинг) на мембрану, то с помощью меченого антигена можно установить и так называемый спектротип антисыворотки, т.е. определить изотип антител, взаимодействующих с данным антигеном.