Исследование лимфоцитов периферической крови

Количество лимфоцитов в периферической крови определяют на основе лейкоформулы и числа лейкоцитов. Подсчет Т- и В-лимфоцитов проводят в суспензии выделенных из крови лимфоцитов. Для получения лимфоцитов наиболее часто применяют метод разделения крови в градиенте плотности.

Выделение лимфоцитов из периферической крови в градиенте плотности

Принцип разделения клеток крови в градиенте плотности основан на различиях в величине их плавучей плотности. При центрифугировании в градиентном растворе клетки крови перемещаются в пробирке до тех пор, пока не достигнут области градиента, где их плавучая плотность равна плотности среды. В качестве градиента плотности для разделения клеток крови можно использовать коммерческий препарат фиколл-400, смесь фиколла с рентгеноконтрастными веществами высокой плотности (урографин, верографин, уротраст) или раствор урографина (верографина).

В центрифужную пробирку добавляют 5 мл рабочего раствора урографина, затем осторожно наслаивают по стенке 5 мл гепаринизированной крови и центрифугируют при 1000 об/мин 35-45 мин. В результате центрифугирования кровь разделяется на 4 фракции: первая фракция на дне пробирки содержит эритроциты и обломки клеток; вторя фракция — это раствор градиентного вещества; третья фракция, расположенная над градиентом в виде светлого кольца, представляет собой суспензию лимфоидных клеток; четвертая фракция образована плазмой и тромбоцитами. Слой лимфоцитов осторожно собирают, переносят в сухую центрифужную пробирку и добавляют 5 мл раствора Хенкса или забуференного физраствора. Содержимое пробирки центрифугируют 5-10 мин при 1000-1500 об/мин. Затем надосадочную жидкость удаляют, а полученный осадок ресуспендируют в растворе Хенкса или забуференном физрастворе и повторяют процедуру ещё раз. Получившийся осадок переносят в пробирку с раствором Хенкса или забуференным физраствором, доводят концентрацию клеток до 2,0-2,5×10⁶ клеток/мл с помощью камеры Горяева и определяют жизнеспособность полученных лимфоцитов с помощью теста с красителем трипановым синим.

Определение жизнеспособности лимфоцитов К 0,1 мл взвеси лимфоцитов в рабочей концентрации добавляют 1 каплю 0,2%-го раствора трипанового синего в 0,9% растворе натрия хлорида, pH 7,2. Суспензию оставляют на 30 с при комнатной температуре, затем в камере Горяева учитывают результат: подсчитывают 100 клеток, отмечая живые (неокрашенные) и погибшие (окрашенные) лимфоциты. Долю жизнеспособных клеток определяют по формуле:
Для дальнейшей работы используют суспензии клеток с жизнеспособностью не менее 95%.

 

Определение количества Т- и В-лимфоцитов в реакции розеткообразования

Метод основан на способности лимфоцитарного CD 2 маркера связывать определенные мембранные рецепторы эритроцитов животных, что приводит к фиксированию последних на поверхности лимфоцитов и образованию хорошо видимых в световой микроскоп комплексов лимфоцит-эритроциты, именуемых розетками. Установлено,что Т-лимфоциты формируют розетки с эритроцитами барана (реакция Е-РОК), а В-лимфоциты — с эритроцитами мыши (реакция М-РОК).

Для учета количества Е-РОК отмытые эритроциты барана доводят раствором Хенкса до 0,5% концентрации. В микропробирки объемом 1,5-2,0 мл вносят 0,1 мл суспензии лимфоцитов в рабочей концентрации и 0,1 мл суспензии эритроцитов барана. Смесь инкубируют при 37ºС 5 мин, далее осаждают клетки центрифугированием при 1000 об/мин в течение 5 мин и инкубируют при 12ºС 60 мин. После инкубации клетки фиксируют добавлением 0,1 мл 0,8%-го раствора глютарового альдегида и через 10 мин смесь центрифугируют при 1000 об/мин 5 мин для осаждения клеток. Из осадка готовят мазки на предметных стеклах, фиксируют в метаноле или смеси Никифорова и окрашивают по Романовскому-Гимзе. При микроскопировании мазков в иммерсионной системе подсчитывают количество розеток (число лимфоцитов, фиксирующих на поверхности 3 и более эритроцитов) на 200 лимфоцитов. Подсчет абсолютного количества осуществляют по формуле:

Для определения количества М-РОК смешивают 0,1 мл лимфоцитов в рабочей концентрации с 0,1 мл 0,5% суспензии отмытых мышиных эритроцитов и 0,1 мл среды Хенкса, содержащей 10% телячьей сыворотки. Смесь инкубируют 15 мин при 37ºС, затем центрифугируют 4 мин при 3000 об/мин и оставляют в холодильнике на 18 ч при 4ºС. Дальнейших ход работы как при определении Е-РОК.

Для выявления и подсчета Т- и В-лимфоцитов человека наиболее точными являются методы, состоящие в выявлении поверхностных маркеров - антигенов системы CD. К этим антигенам биопромышленность готовит стандартные моноклональные антитела и наборы реактивов, позволяющие в иммунолюминесцентных и цитотоксических тестах выявить Т- и В-лимфоциты, их субпопуляции, другие клетки иммунной системы. Так, маркером Т-лимфоцитов служит антиген CD3, В-лимфоцитов - CD22, хелперных Т-лимфоцитов - CD4, цитотоксических лимфоцитов - CD8, естественных киллеров - CD 16, CD56.