Проявляющие устройства и реактивы.

Для проявления разделенных веществ используют подходящие устройства, пригодные для нанесения реактивов на пластинку (посредством опрыскивания, погружения или обработки парами) и, если это необходимо, для нагревания.

Документирование. Для обеспечения документирования проявленных хроматограмм могут быть использованы различные приемы, например фотографирование или создание компьютерного файла.

МЕТОДИКА

"Если в частной статье нет других указаний, хроматографическое разделение выполняют восходящим способом.

Предпочтительнее использовать такие подвижные фазы, которые обеспечивают величины R_F испытуемых соединений в пределах от 0,3 ДО 0,7.

Слой жидкости в хроматографической камере должен быть таким, чтобы после помещения в него пластинки пятна или полосы находились над уровнем жидкости.*

Нанесение. Указанные объемы растворов наносят на подходящем расстоянии от нижнего края и от боковых краев пластинки на линию, параллельную нижнему краю пластинки; расстояние между центрами круглых пятен должно составлять не менее 10 мм (5 мм для пластинок для высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ)), расстояние между краями полос — не менее 5 мм (2 мм для пластинок для ВЭТСХ). Растворы наносят минимальными порциями для получения пятен диаметром 2—-5 мм (1—2 мм для пластинок для ВЭТСХ) или полос длиной 10—20 мм (5—10 мм для пластинок для ВЭТСХ) и шириной 1—2 мм.

Если частная статья предусматривает использование наряду с обычными пластинками и пластинок для ВЭТСХ, рабочие условия для высокоэффективной тонкослойной хроматографии указываются в скобках [ ] после указания условий для обычных пластинок.

Вертикальное элюирование. Стенки хроматографической камеры выстилают фильтровальной бумагой. Подвижную фазу наливают в камеру в количестве, достаточном для того, чтобы после смачивания фильтровальной бумаги покрыть дно камеры слоем жидкости, необходимым для хроматографирования. Для насыщения хроматографическую камеру с подвижной фазой закрывают крышкой и выдерживают в течение 1 ч при температуре от 20 °С до 25 °С. Если в частной статье нет других указаний» хро-матографирование проводят в насыщенной камере. Наносят указанные объемы растворов, как описано выше. После испарения раствори-

телей из нанесенных проб пластинку помещают в хроматографическую камеру как можно более вертикально, следя за тем, чтобы пятна.•-полосы находились выше поверхности подвижной фазы. Камеру закрывают, оставляют ее при температуре от 20 °С до 25 °С в защищенном от попадания прямых солнечных лучей месте. После того, как подвижная фаза пройдет расстояние, указанное в частной статье, пластинку вынимают, сушат и обнаруживают пятна способом, указанным в частной статье.

В случае двухмерной хроматографии после первого хроматографирования пластинку сушат и выполняют второе хроматографирование в направлении, перпендикулярном первому.

Горизонтальное элюирование. Наносят указанные объемы растворов, как описано выше. После испарения растворителей из нанесенных проб в желоб хроматографической камеры вводят с помощью шприца или пипетки достаточное количество подвижной фазы, помещают пластинку, убеждаясь, что она расположена горизонтально и подсоединена к устройству для подачи подвижной фазы, в соответствии с инструкциями производителя. Если указано в частной статье, пластинку элюируют, начиная одновременно с двух концов. Камеру закрывают и проводят хроматографирование при температуре от 20 °С до 25 °С. После того, как подвижная фаза пройдет расстояние, указанное в частной статье, пластинку вынимают, сушат и обнаруживают пятна указанным способом.

В случае двухмерной хроматографии после первого хроматографирования пластинку сушат и выполняют второе хроматографирование в направлении, перпендикулярном первому.

ВИЗУАЛЬНАЯ ОЦЕНКА

Идентификация. Основное пятно на хро-матограмме испытуемого раствора сравнивают с соответствующим пятном на хроматограмме раствора сравнения, сравнивая цвет, размер и фактор подвижности (R_F) *(или фактор удерживания (R_f)f обоих пятен.

Фактор подвижности (R_F) определяют как отношение расстояния от точки нанесения пятна до центра пятна после хроматографирования к расстоянию, пройденному фронтом растворителя от точки нанесения.

Проверка разделяющей способности неподвижной фазы для идентификации. Обычно для оценки пригодности достаточно испытания на пригодность неподвижной фазы, описанного в статье 4Л.1. Реактивы. В особых случаях дополнительные требования указывают в частных статьях.

Сопутствующие примеси. Дополнительное пятно (пятна) на хроматограмме испытуемого раствора сравнивают визуально с соответствующим пятном (пятнами) на хроматограмме

2.2.27. Тонкослойная хроматография

 

 

раствора сравнения. В качестве стандартного образца для приготовления раствора сравнения используют как саму примесь (примеси), так и различные разведения испытуемого раствора.

Проверка разделяющей способности. Требования для проверки разделяющей способности приводят в соответствующих частных статьях.

Проверка чувствительности. Чувствительность считается удовлетворительной, если на хроматограмме наиболее разведенного раствора сравнения четко обнаруживается пятно или полоса.

^Способы оценки содержания примесей

методом ТСХ При контроле примесей нежелательно включение в частную статью требования отсутствия пятна контролируемой примеси на хроматограмме испытуемого раствора. Методом ТСХ могут контролироваться как конкретно указываемые (специфицированные) примеси, так и сумма примесей.

Контроль специфицированных примесей. Контроль специфицированных примесей применяют в тех случаях, когда содержание каких-то конкретных примесей, возникающих в процессе производства лекарственного средства или его хранения, должно быть ограничено ввиду их токсичности или ло другим соображениям. При контроле специфицированных примесей обычно используют сравнение пятен регламентированных примесей на хроматограммах испытуемого раствора и раствора сравнения.

Контроль общего содержания примесей. В тех случаях, когда нет оснований считать какие-то примеси особо токсичными, часто не так важно знать их истинное содержание. Важно знать, что это содержание не превосходит определенного уровня. В таких случаях используют метод внутренней нормализации: в качестве растворов сравнения обычно используют рас-теоры самой испытуемой субстанции различной <онцентрации, а содержание примесей находят з пересчете на эту субстанцию. В зависимости эт количества различных растворов субстанции, наносимых на хроматограмму в виде растворов сравнения, контроль общего содержания приме-зей может быть одноуровневым, двухуровневым л трехуровневым. В двух- и трехуровневых вариантах возможна регламентация и общей суммы тримесей.

КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ ИЗМЕРЕНИЯ

Требования к разрешению и разделению "оиводят в частных статьях.

В том случае, когда вещества, разделяемые методом тонкослойной хроматографии, погло-лаают или флуоресцируют в ультрафиолетовом «пи видимом свете, их можно количественнЪ лределить непосредственно на пластинке, используя подходящее оборудование. Для этого смеряют отражение или пропускание падающе-•q света, передвигая пластинку или измеряющее

устройство. Аналогичным образом, используя подходящее оптическое оборудование, можно измерять флуоресценцию. Вещества, содержащие радионуклиды, могут быть количественно определены тремя способами:

- непосредственно на пластинке — передви
жением пластинки вдоль подходящего счетчика
радиоактивности или счетчика радиоактивности
вдоль пластины (см. статью Радиофармацевти
ческие препараты);

- разрезанием пластинки на полосы и из
мерением радиоактивности на каждой полосе, с
использованием подходящего счетчика радиоак
тивности;

- ооскребанием неподвижной фазы, рас
творением ее в подходящем сцинтилляционном
коктейле и измерением радиоактивности с ис
пользованием жидкостного сцинтилляционного
счетчика.

Оборудование. Оборудование для измерений непосредственно на пластинке включает в себя:

- устройство для точного нанесения в опре
деленном месте пластинки необходимого коли
чества вещества;

- механическое устройство для передвиже
ния пластинки или измерительного устройства
вдоль осей X или У;

- регистрирующее устройство и интегратор
или компьютер;

- для веществ, поглощающих или флуо
ресцирующих в ультрафиолетовом или види
мом свете: для измерения отражения или про
пускания используются фотометр с источником
света, оптическое устройство, генерирующее
монохроматический свет, и фотоэлемент соот
ветствующей чувствительности; в том случае,
когда измеряется флуоресценция, требуется до
полнительно монохроматический фильтр для
выбора соответствующей спектральной области
излучаемого света;

- для веществ, содержащих радионуклиды:
подходящий счетчик радиоактивности; для него
необходимо проверить линейность диапазона.

Методика. Готовят раствор испытуемого образца (испытуемый раствор), как указано в частной статье, и, при необходимости, растворы стандартных образцов анализируемых веществ (растворы сравнения), используя тот же растворитель, что и для приготовления испытуемого раствора. Одинаковые объемы каждого из растворов наносят на пластинку и хроматографируют.

Вещества, поглощающие или флуоресцирующие в ультрафиолетовом или видимом свете. Готовят и наносят не менее трех растворов сравнения, концентрации которых охватывают ожидаемое значение концентрации в испытуемом растворе (около 80 %, 100 % и 120 % от этой концентрации). Опрыскивают, если необходимо, указанным реактивом и регистрируют от-

Государственная фармакопея Республики Беларусь

 

 

ражение, пропускание или флуоресценцию на хроматограммах испытуемого раствора и растворов сравнения. По полученным данным рассчитывают количество вещества в испытуемом растворе.

Вещества, содержащие радионуклиды. Готовят и наносят испытуемый раствор, содержащий около 100 % ожидаемого значения концентрации. Измеряют радиоактивность как функцию длины пути и записывают радиоактивность каждого полученного пика в процентах от суммарной радиоактивности.

Критерии пригодности системы описаны в статье 2.2.46. Хроматографические методы разделения. Допустимые величины изменений, которые можно вносить с хроматографическую систему для удовлетворения критериям пригодности системы, также указаны в данном разделе.

01/2013:20228