РАСТИТЕЛЬНОМ СЫРЫЕ

•*•*'>. ^ I -:

ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: афлбтотины являются высокотоксичными и канцерогенными соединениями. Все манипуляции поъозыояо-

nWJW npQWfam в вытяжной шкафр Особые меры предосторожности, /шш ш шюль-

зование закрытого бокса с перчатквми, применяют при работе с токсинами в сухой

форме из-за их электролитических свойств

и склонности к распространению по всей рабочей поверхности. Процедуры двконтъми* нации лабораторных отходов, содержащих афлатоксины, были разработаны Междун& родным агентством по изучению рака (tARC).

Афлатоксины являются микотоксинами природного происхождения, продуцируемыми в основном Aspergillus flavus и Aspergiltus parasiticus. Эти грибы широко распространены в природе и наиболее часто встречаются при росте определенных зерен в стрессовых условиях, таких как засуха. Плесень встречается в почве, гниющей растительности, сене и зернах, претерпевающих микробное гниение, и поражает все типы органических субстратов при любых условиях, благоприятствующих ее росту. Благоприятные условия включают высокую влажность и высокую температуру. В природе продуцируется как минимум 13 различных типов афлатоксинов, большинство из которых является высокотоксичными и канцерогенными. Афлатоксин В₁ считается наиболее токсичным. Лекарственное растительное сырье, которое склонно к контаминации афла-токсинами, испытывают валидированным методом.

Если в частной статье нет других указаний, лекарственное растительное сырье должно содержать не более чем 2 мкг/кг афлатоксина В_г Уполномоченный орган может установить предельное содержание суммы афлатоксинов B_1t 3. G₁ и G₂ не более 4 мкг/кг.

Метод, описанный ниже, приведен в качестве примера метода, подходящего для анализа корневищ имбиря, плодов сенны «корней дьявольского когтя. Пригодность метода для анализа другого лекарственного растительного сырья должна быть доказана или должен использоваться другой валидированный метод.

 

i.

МЕТОД

Жидк^ная хроматография (2.220).

Афпатоксины подвержены деструт&ш при воздействии света. Определение проводят с защитой от дневного света с помощью УФ- абсорбирующвй пленки на окнах в комбинации с приглушенным светом или занавесок, жалю-зей, ставней в комбинации с обычным светом (могут применяться флуоресцентные лампы). Растворы, содержащие афлатоксины, защищают от воздействия дневного света.

Стеклянную посуду щщ использованием

ополаскивают to % (об/об) раствором кислоты серной Pw затем тщательно промывают водой дистштфОваннойРц& полного отсутствия кислоты.

Испмму^&раетор. Используют иммун-нсьаффиииую колонку, содержащую антитела к

афлатоксину В₁ с емкостью не менее 100 нг афлатоксина B^ff отфывгсшмтгьюнеменееЗО %"лри

прохождении черезмев раствора 5 нг«флат*

сина В₁ в смеси *и 12,5 мл юетанояа Р и 87,5 мл воды Р. Темпврвгур^иммужо-аффиннойколон-кидеведя? до комнатной. К 5,00 г измельченного афБЯ^500Н2.91ОДйр1чбавля101г1^Ю мл смеси из 30'объемов воды Р и 70 объемов метанола Р и экстрагируют при юэдвйсгаии р!ьтраз§ука в течем»» 30 шин: Фильтруют через складчатый бумажный фильтр. 10,0 мл прозрачного фильтрата переносят с помощью пипетки в коническую колбу вместимостью 150 мл, прибавляют 70 мл воды Р. 40 мл полученного раствора пропускают через иммунно-аффинную колонку со скоростью 3 мл/мин (не допускается превышение скорости до 5 мл/мин). Колонку дважды промывают водой Р порциями по 10 мл со скоростью, непревышающей 5 мл/мин, и высушивают с использованием легкого вакуума в течение 5—10 с или пропусканием через колонку воздуха с использованием шприца в течение 10 с. В колонку вводят 0,5 w\ метанола Р и дают пройти под действием силы тяжести. Элюат собирают в мерную колбу вместимостью 5 мл. Через 1 мин наносят вторую порцию 0,5 мл метанола Р. Через последующую 1 мин наносят третью порцию 0,5 мл метанола Р. Собирают большую часть элюата при помощи пропускания воздуха через колонку или при помощи вакуума. Доводят водой Р до объема 5 мл и тщательно перемешивают. Прозрачный раствор может быть использован для анализа. В ином случае полученный раствор пропускают через одноразовый фильтр. Используют одноразовый фильтр (например, по-литетрафторэтиленовый фильтр с размером пор 0,45 мкм), который не вызывает потери (не удерживает) афлатоксинов.

Первичный основной раствор афлатоксина В_г Афлатоксин В₁ Р растворяют в смеси из 2 объемов ацетонитрила Р и 98 объемов толуола Р для получения раствора с концен-

Государственная фармакопея Республики Беларусь

 

грацией 10 мкг/мл. Для определения точной концентрации афлатоксина В₁ в основном растворе записывают спектр поглощения (2.2.25) в диапазоне длин волн 330—370 нм с использованием кварцевых кювет. Массовую концентрацию афлатоксина В, в мкг/мл рассчитывают по формуле:

е-1

где:

А — оптическая плотность в максимуме полученного спектра;

М — молярная масса афпатоксйна В, (312 г/моль);

£ — молярный коэффициент поглощения афлатоксина В₁ в смеси толуол — ацетонитрил (1930м²/моль);

/ — длина оптического пути (1 см).

Вторичный основной раствор афлатоксина В_г Вторичный основной раствор, содержащий tOO нг/мл афлатоксина В₁₍ готовят разведением первичного основного раствора афлатоксина В; смесью ацетонитрил — толуол (2:98, об/об). Колбу тщательно обертывают алюминиевой фольгой и хранят при температуре ниже 4 °С. Перед использованием алюминиевую фольгу не удаляют, пока содержимое не достигнет комнатной температуры. Если раствор хранится в течение длительного периода времени (например, 1 месяц), взвешивают колбу и записывают массу перед и после каждого использования раствора.

Стандартные растворы афлатоксина В_г В мерные колбы вместимостью 250 мл помещают объемы вторичного основного раствора афлатоксина В₁₍ указанные в таблице 2.8.1 8.-1. Пропускают поток азота при комнатной температуре до полного испарения растворителя, В каждую колбу прибавляют 75 мл метанола Р, выдерживают до растворения афлатоксина В₁ и доводят водой Р цо объема 250 мл.

Таблица 2.8. 18.-1 Стандартные растворы афлатоксина В₁

 

	Объем	Конечная
Стандартный раствор	вторичного основного раствора,	концентрация стандартного раствора,
	мкл	нг/мл
		0,05
		0,1
		0,2
		0,3
		0,4

Градуировочный график. Строят градуиро-вочный график с использованием стандартных растворов афлатоксина В, от 1 до 5, который охватывает диапазон, эквивалентный 1—8 мкг/кг

афлатоксина В₁ в лекарственном растительном сырье. График проверяют на линейность. Если содержание афлатоксина В₁ в испытуемом образце выходит за пределы калибровки, испытуемый раствор может быть разведен до получения подходящей концентрации афлатоксина. Условия хроматографирования:

- колонка длиной 0,25 м и внутренним ди
аметром ^Г4,6 мм, заполненная силикагелем ок-
тадецилсилильным для хроматографии Р с
размером частиц 5 мкм;

- подвижная фаза:

 

- подвижная фаза А (для постколоноч
ной дериватизации с фотохимическим реакто
ром или пиридиния бромидом): ацетонитрил
Р — метанол Р — вода Р (2:3:6, об/об/об);

- подвижная фаза В (для постколоноч
ной дериватизации с бромом, получаемым элек
трохимически): 0,12 г калия бромида Р и 350 мкл
кислоты азотной разведенной Р1 прибавляют к
1 л подвижной фазы А;

 

- скорость подвижной фазы: 1 мл/мин;

- флуоресцентный детектор, фильтр воз
буждения 360 нм, фильтр эмиссии 420 нм или
эквивалентные. Рекомендуемые настройки для
подходящих детекторов — 365 нм (длина волны
возбуждения) и 435 нм (длина волны эмиссии);

- объем вводимой пробы: 500 мкл.

Постколоночная дериватизация с пиридиния гидробромидом пербромидом (РВРВ):

- безимпульсный насос;

- Т-отрезок с нулевым мертвым объемом;

- политетрафторэтиленовая реакционная
трубка, длиной 0,45 ми внутренним диаметром
0,5 мм;

-подвижная фаза А;

— постколоночный дериватизирующий реак- тив:50мг пиридиния гидробромида пербромидаР растворяют в 1000 мл воды Р (хранят с защитой от света и используют в течение 4 дней);

— скорость потока дериватизирующего реактива: 0,4 мл/мин.

Постколоночная дериватизация с фотохимическим реактором (PHRED):

- реактор с одной УФ-лампой с максималь
ной интенсивностью при длине волны 254 нм с
низким давлением ртути (минимум 8 Вт);

- полированная пластина-держатель;

- витой реактор: политетрафторэтиленовая
трубка, плотно намотанная вокруг УФ-лампы,
длиной 25 м, внутренним диаметром 0,25 мм и
номинальным свободным объемом 1,25 мл;

- время экспозиции: 2 мин;

- подвижная фаза А.

Постколоночная.дериватизация с бромом, получаемым электрохимически (KOBRA):

КОВОД-ячейка: электрохимическая ячейка, генерирующая реактивную форму брома для дериватизации афлатоксинов, выражающу-

Z8.22. Определение охратокшт А в лекарственном растительном сырье

 

 

опять процедуры обеззараживания стеклянной лабораторной посуды, содержащей охратоксин А (см. приложение).

Лекарственное растительное сырье, которое склонно к контаминации охратоксином А, испытывают валидированным методом.

Метод, описанный ниже, приведен в качестве примера метода, подходящего для анализа корней солодки и экстракта солодки. Пригодность метода для анализа другого лекарственного растительного сырь» должна быть доказана или должен использоваться другой валидированный метод.

МЕТОД

Жидкостная хроматография (2.2,29),

Используют посуду из коричневого стекла, не содержащую остатков детергентов. При необходимости стеклянную посуду перед использованием ополаскивают 10 % (об/об) раствором кислоты серной Р и затем тщательно промывают водой дистиллированной Р до полного отсутствия кислоты.

Раствор А. Смешивают 80 объемов водь/Р, предварительно доведенной кислотой м^рв- вьиной безводной Р до рН 2,3, и 20 объемов ацетонитрила Р.

Испытуемый раствор. Используют им-мунно-аффинную колонку, содержащую антитела кохратоксину Асемкостью неменее 100 нг охратоксина А и открываемостью не менее 70 %. Температуру иммунно-аффинной колонки доводят до комнатной.

К 2,00 г измельченного сырья (250) (2.9.12) прибавляют 80 мл раствора 30 г/л натрия гидрокарбоната Р и экстрагируют при воздействии ультразвука в течение 30 мин (через 15 мин сменяют воду в ультразвуковой бане). Охлаждают до комнатной температуры, доводят до объема 100,0 мл (VJ этим же растворителем и центрифугируют. 5,0 мл (V,) прозрачной надосадочной жидкости тщательно перемешивают с 30 мл буферного раствора рН 7,4 Р и весь полученный объем пропускают через иммунно-аффинную колонку со скоростью 3 мл/мин (не допускается превышение скорости до 5 мл/мин). Колонку сначала промывают 10 мл буферного раствора рН 7,4 Р, затем дважды промывают водой Р порциями по 10 мл со скоростью, не превышающей 5 мл/мин, и высушивают с использованием легкого вакуума в течение 5—10 с или пропусканием через колонку воздуха с использованием шприца в течение 10 с. В колонку Вводят 0,5 Мл метанола Р и дают пройти* под Действием силы тяжести.

Элюат собирают в контейнер вместимостью 4 мл. Через 30 с наносят вторую nof цию 0.5 мл метанола Р, дают пройти через колонку под действием силы тяжести и собирают в этот же контейнер. Через последующие 30 с наносят третью порцию 0,5 мл метано-

Р. Собирают весь удерживаемый в колонке объем при помощи пропускания воздуха через колонку или при помощи вакуума. Объединенные элюаты выпаривают досуха с использованием нагревательного блока в среде азота (40 °G). Сухой остаток растворяют в 0,5 мл (У₂) раствора А. Прозрачный раствор может быть использован для анализа. В ином случае полученный раствор пропускают через одноразовый фильтр. Используют одноразовый фильтр (например, политетрафтор-этиленовый фильтр с размером пор 0,45 мкм), который не вызывает потери (не удерживает) охратоксина А.

Первичный основной раствор охратоксина А. 1,0 мл раствора охратоксина А Р доводят метанолом Р до объема 100,0 мл и тщателъно перемешивают.

Вторичный основной раствор oxpajmbtf- сина А. 10,0 мл первичного основного раствора охратоксина А доводят метанолом Р до объема 100,0 мл и тщательно перемешивают.

Стандартные растворы охратоксина А. Помещают объемы первичного основного раствора^ охратокисна А или вторичного основного раствора охратоксина А, указанные в таблице 2.S.22.-1, в отдельные колбы и доводят раствором А до объема 50,0 мл.

Таблица 2.8.22.-1 Стандартные растворы охратоксина А

 

	Объем	Конечная
Стандартный	первичного основного	концентрация охра-токсина А в
раствор	раствора охратоксина А, мкл	стандартном растворе, нг/мл
		2,5
	Объем	Конечная
Стандартный	вторичного основного	концентрация охра-токсина А в
раствор	раствора охратоксина А, ftjlf П	стандартном растворе,
	MILM	нг/мл
	sbo	0,5
	юс	°-1

Градуировочный график. Строят градуиро-вочный график с использованием стандартных растворов охратоксина А от 1 до 7, который охватывает диапазон, эквивалентный 0,5—250 мкг/кг охратоксина А в лекарственном растительном

некоторых микроорганизмов в нестерильных лекарственных средствах потенциально может уменьшить терапевтическую активность продукта или даже инактивировать его, кроме этого существует возможность неблагоприятного воздействия на организм пациента. Поэтому производители должны обеспечить выполнение действующего руководства по Надлежащей производственной практике при производстве, хранении и распространении лекарственных средств для гарантирования их низкой биологической загрязненности.

Микробиологическое испытание нестерильных лекарственных средств проводят в соответствии с методами, приведенными в общих статьях 2.6. 12, 2.6.13 и 2.6.31. Критерии приемлемости для нестерильных лекарственных средств, основанные на общем количестве аэробов (ОКА) и на общем количестве грибов (ОКГ), приведены ниже.

Критерии приемлемости основываются на отдельных результатах или на средних результатах параллельных подсчетов в случае их проведения (например, в методах чашечного подсчета).

Перечень специфицированных микроорганизмов, для которых установлены критерии приемлемости, представлен ниже. Данный список не является обязательно исчерпывающим, и для некоторых лекарственных средств может быть необходимым включение испытания на другие микроорганизмы в зависимости от природы исходного материала и процесса производства.

А. Лекарственные средства растительного происхождения, содержащие лекарственное растительное сырье с или без вспомогательных веществ, предназначенные для приготовления настоев и отваров с