Гибридизация нуклеиновых кислот на твердых подложках
Обобщенная схема гибридизационного анализа на нитроцеллюлозных фильтрах (рис. 41) включает следующие этапы: 1. Подготовка исследуемой ДНК для фиксации на нитроцеллюлозном фильтре. Обычно исследуемую ДНК фрагментируют с помощью эндонуклеаз рестрикции и фракционируют полученные фрагменты ДНК методом гельэлектрофореза в агарозе (рис. 41 - 1). Гель помещают в щелочной раствор, при этом двойная спираль денатурирует и облегчает связывание отрицательно заряженной ДНК с положительно заряженной мембраной фильтра для дальнейшей гибридизации. При этом разрушаются и остатки РНК. 2. Нитроцеллюлозный фильтр помещают сверху агарозного геля таким образом, чтобы осуществлялось полное соприкосновение фильтра и геля (рис. 41 – 2). Сверху фильтра кладут несколько слоев фильтровальной бумаги и небольшой груз, чтобы обеспечить возникновение капиллярного тока жидкости через гель на фильтр. Буфер переносится капиллярными силами из участка с высоким содержанием воды (из губки, смоченной щелочным раствором) в зону с низким содержанием воды – на нитроцеллюлозный фильтр. При этом происходит и перенос ДНК из геля на фильтр. Полианионная ДНК связывается с положительно заряженным нитроцеллюлозным фильтром силами ионообменных взаимодействий.
Рис. 41. Схема гибридизации нуклеиновых кислот на нитроцеллюлозных фильтрах (гибридизация по Саузерну)
3. Для окончательного закрепления ДНК на фильтре его нагревают в вакууме до температуры 80°С в течение двух часов. В случае использования нейлоновых мембран, последнюю освещают ультрафиолетовым излучением. 4. Нанесение меченой одноцепочечной ДНК-зонда, которая при определенных условиях (температуре и ионной силе) образует водородные связи с ДНК-мишенью (рис. 41 – 3). 5. Промывание фильтра для удаления избытка несвязавшегося меченого ДНК-зонда. 6. Детекция гибридных молекул зонд/мишень с помощью специфичной и высокочувствительной системы (радиоактивной, хемилюминесцентной, флуоресцентной) (рис. 41 – 4). Перенос ДНК из геля на фильтр носит название Саузерн-блоттинга в честь Эдвина Саузерна, который изобрел этот метол. Использующиеся в литературе термины “Нозерн-блоттинг” и “Вестерн-блоттинг” относятся к переносу РНК и белков соответственно. Эти названия — в переводе с английского “северный” и “западный” -не имеют никакого отношения к сторонам света и были придуманы остроумными коллегами Саузерна (Southern — южный). Тем самым они как бы напутствовали Саузерна на разработку новых методов переноса макромолекул, а также четко обозначили, о переносе каких макромолекул идет речь. Кроме того, все увидели, что шутить умеют не только физики, но и биологи.
|
