Студопедия Главная Случайная страница Обратная связь

Разделы: Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

Гибридизация нуклеиновых кислот на твердых подложках





Обобщенная схема гибридизационного анализа на нитроцеллюлозных фильтрах (рис. 41) включает следующие этапы:

1. Подготовка исследуемой ДНК для фиксации на нитроцеллюлозном фильтре. Обычно исследуемую ДНК фрагментируют с помощью эндонуклеаз рестрикции и фракционируют полученные фрагменты ДНК методом гельэлектрофореза в агарозе (рис. 41 - 1). Гель помещают в щелочной раствор, при этом двойная спираль денатурирует и облегчает связывание отрицательно заряженной ДНК с положительно заряженной мембраной фильтра для дальнейшей гибридизации. При этом разрушаются и остатки РНК.

2. Нитроцеллюлозный фильтр помещают сверху агарозного геля таким образом, чтобы осуществлялось полное соприкосновение фильтра и геля (рис. 41 – 2). Сверху фильтра кладут несколько слоев фильтровальной бумаги и небольшой груз, чтобы обеспечить возникновение капиллярного тока жидкости через гель на фильтр. Буфер переносится капиллярными силами из участка с высоким содержанием воды (из губки, смоченной щелочным раствором) в зону с низким содержанием воды – на нитроцеллюлозный фильтр. При этом происходит и перенос ДНК из геля на фильтр. Полианионная ДНК связывается с положительно заряженным нитроцеллюлозным фильтром силами ионообменных взаимодействий.

 

Рис. 41. Схема гибридизации нуклеиновых кислот на нитроцеллюлозных фильтрах (гибридизация по Саузерну)

 

3. Для окончательного закрепления ДНК на фильтре его нагревают в вакууме до температуры 80°С в течение двух часов. В случае использования нейлоновых мембран, последнюю освещают ультрафиолетовым излучением.

4. Нанесение меченой одноцепочечной ДНК-зонда, которая при определенных условиях (температуре и ионной силе) образует водородные связи с ДНК-мишенью (рис. 41 – 3).

5. Промывание фильтра для удаления избытка несвязавшегося меченого ДНК-зонда.

6. Детекция гибридных молекул зонд/мишень с помощью специфичной и высокочувствительной системы (радиоактивной, хемилюминесцентной, флуоресцентной) (рис. 41 – 4).

Перенос ДНК из геля на фильтр носит название Саузерн-блоттинга в честь Эдвина Саузерна, который изобрел этот метол. Использующиеся в литературе термины “Нозерн-блоттинг” и “Вестерн-блоттинг” относятся к переносу РНК и белков соответственно. Эти названия — в переводе с английского “северный” и “западный” -не имеют никакого отношения к сторонам света и были придуманы остроумными коллегами Саузерна (Southern — южный). Тем самым они как бы напутствовали Саузерна на разработку новых методов переноса макромолекул, а также четко обозначили, о переносе каких макромолекул идет речь. Кроме того, все увидели, что шутить умеют не только физики, но и биологи.

 







Дата добавления: 2015-09-04; просмотров: 606. Нарушение авторских прав; Мы поможем в написании вашей работы!




Композиция из абстрактных геометрических фигур Данная композиция состоит из линий, штриховки, абстрактных геометрических форм...


Важнейшие способы обработки и анализа рядов динамики Не во всех случаях эмпирические данные рядов динамики позволяют определить тенденцию изменения явления во времени...


ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ МЕХАНИКА Статика является частью теоретической механики, изучающей условия, при ко­торых тело находится под действием заданной системы сил...


Теория усилителей. Схема Основная масса современных аналоговых и аналого-цифровых электронных устройств выполняется на специализированных микросхемах...

Шрифт зодчего Шрифт зодчего состоит из прописных (заглавных), строчных букв и цифр...

Краткая психологическая характеристика возрастных периодов.Первый критический период развития ребенка — период новорожденности Психоаналитики говорят, что это первая травма, которую переживает ребенок, и она настолько сильна, что вся последую­щая жизнь проходит под знаком этой травмы...

РЕВМАТИЧЕСКИЕ БОЛЕЗНИ Ревматические болезни(или диффузные болезни соединительно ткани(ДБСТ))— это группа заболеваний, характеризующихся первичным системным поражением соединительной ткани в связи с нарушением иммунного гомеостаза...

Опухоли яичников в детском и подростковом возрасте Опухоли яичников занимают первое место в структуре опухолей половой системы у девочек и встречаются в возрасте 10 – 16 лет и в период полового созревания...

Способы тактических действий при проведении специальных операций Специальные операции проводятся с применением следующих основных тактических способов действий: охрана...

Искусство подбора персонала. Как оценить человека за час Искусство подбора персонала. Как оценить человека за час...

Studopedia.info - Студопедия - 2014-2025 год . (0.013 сек.) русская версия | украинская версия