Студопедия — Гибридные векторы
Студопедия Главная Случайная страница Обратная связь

Разделы: Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

Гибридные векторы






Фаговые векторы позволяют клонировать фрагменты ДНК длиной 15-25 т.п.н., что недостаточно для клонирования генов животных и растений, длина которых превышает 35-40 т.п.н. Требуемой емкостью обладают векторные молекулы, называемые космидами.

Космиды представляют собой небольшие плазмиды, в которые in vitro введены cos -сайты ДНК фага λ. Отсюда происходит название всего типа данных векторов (cosmid).

Космиды – один из видов гибридных векторов, которые реплицируются, используя плазмидный тип репликации, и обладают способностью упаковываться in vitro в оболочки частиц фага λ. Такие векторы могут включать до 40 т.п.н. чужеродной ДНК (рис. 26)

 

 

Рис. 26. Схема, демонстрирующая принцип конструирования рекомбинантных ДНК на основе космидного вектора

 

Наличие cos -сайтов в ДНК является единственным необходимым условием упаковываемости ДНК в фаговые частицы. Это означает, что последовательность нуклеотидов λ-ДНК, расположенная между двумя c os-сайтами, которая заключает в себе весь фаговый геном (35-45 т.п.н.), может быть замещена in vitro на аналогичный по длине фрагмент чужеродной ДНК и упакована в фаговые частицы. Такая искусственная фаговая частица оказывается нежизнеспособной. Однако, после адсорбции химерной фаговой частицы на поверхности бактериальной клетки, заключенная в ней ДНК проникает (вводится фаговой частицей) внутрь бактерии и начинает автономно реплицироваться как плазмида, размер которой составляет 30-40 т.п.н. Поскольку такая плазмида (космида) содержит в своем составе селектируемые маркеры в виде генов устойчивости к антибиотикам, ее поддерживают в бактериальных клетках путем выращивания бактерий на среде с соответствующими антибиотиками. Несмотря на то, что емкость космидных векторов значительно выше фаговых, эффективность клонирования в космидах ниже, хотя и достигает в ряде случаев 105-106 колоний на 1 мкг клонируемой ДНК

Стадия упаковки ДНК космид в фаговые частицы используется лишь для облегчения процесса введения рекомбинантных ДНК большого размера внутрь бактериальных клеток. Такой процесс имитирует проникновение фаговой хромосомы в бактерии во время фаговой инфекции.

В случае космид сходство между их проникновением в бактериальные клетки и фаговой инфекцией на этом заканчивается. Однако сходство является более глубоким в случае векторов, называемых фазмидами. Фазмиды представляют собой векторные молекулы ДНК, которые содержат в себе генетические элементы плазмид и хромосом бактериофагов. Они могут обладать емкостью в отношении клонируемой ДНК, характерной для лямбда-векторов, и существовать в определенных условиях в бактериальных клетках в виде плазмиды или же упаковываться в фаговые частицы in vivo при изменении этих условий.

Векторные системы для клонирования очень крупных фрагментов ДНК

Векторные системы, способные интегрировать крупные вставки (>100т. п. н.), имеют большую ценность при анализе сложных эукариотических геномов. Без таких векторов не обойтись, например, при картировании генома человека или при идентификации отдельных генов/

Для клонирования фрагментов ДНК размером от 100 до 300 т. п. н. был сконструирован низкокопийный плазмидный вектор на основе бактериофага Р1. Природная форма бактериофага Р1 Е. coli в виде профага не интегрирует в хромосому, а существует в плазмидной форме. Фактически ДНК фага Р1 представляет собой природную фазмиду. Вектор РАС — химерная конструкция, называемая искусственной хромосомой на основе фага Р1

(Р1- artificial chromosomes).

В 1992 году Хируоко Шизуя создал также очень стабильный вектор, способный интегрировать вставки длиной от 150 до 350 т. п. н., на основе F-плазмиды (F-фактора, или фактора фертильности) Е. coli, которая представлена в клетке одной или двумя копиями, с селекционной системой lacZ' векторов pUC. Эта конструкция называется бактериальной искусственной хромосомой (ВАС, англ. bacterial artificial chromosomes) (рис. 27).

Рис. 27. Клонирование фрагментов ДНК большого размера с помощью ВАС.

 

Манипуляции процедуры клонирования фрагментов ДНК в клетках E.coli с использованием ВАС-вектора осуществляется в такой же последовательности, как было рассмотрено в случаях с применением плазмидных векторов pBR322 и pUC19 (рис. 20. 22). Особо следует отметить, что трансформация бактериальных клеток с помощью рекомбинантных ДНК на основе ВАС проводится методом электропорации.

Искусственные дрожжевые хромосомы (YAC – yest artificial chromosome). Эта система предназначена для клонирования очень больших фрагментов ДНК (до 2000 т.п.н.), которые потом поддерживаются в дрожжевой клетке как отдельные хромосомы (рис. 28). YAC-система очень стабильна.

 

Рис. 28. YAC-система клонирования

YAC-плазмида (pYAC) содержит селективный маркерный ген E. coli (Ampr), сайт инициации репликации, функционирующий в E. coli (oriE); сегмент дрожжевой ДНК, включающий участки U RA3, CEN, TRP1 и ARS (CEN - последовательность, выполняюшая центромерную функцию, ARS - дрожжевая автономно реплицирующаяся последовательность, эквивалентная дрожжевому сайту инициации репликации, URA3 - один из генов биосинтеза урацила, TRP1 - один из генов биосинтеза триптофана). Т - это теломерные области дрожжевой хромосомы, SmaI — сайт, по которому осуществляется клонирование.

pYAC сначала обрабатывают Sma I, Ват HIи щелочной фосфатазой, а затем сшивают с фрагментом ДНК длиной от 100 до 2000 т.п.н. Конечная генетическая конструкция содержит клонированную ДНК и может стабильно поддерживаться в дрожжевых клетках Ura-Trp-.

Способы трансформации дрожжевых клеток:

1. Экзогенную ДНК добавляют к клеткам дрожжей, клеточные стенки которых удалены химически или энзиматически (сферопласты).

2. Клетки перед добавлением чужеродной ДНК обрабатывают ацетатом лития.

3. Электропорация.

YАС-вектор напоминает хромосому, поскольку он содержит последовательность, функционирующую как сайт инициации репликации ДНК (автономно реплицирующуюся последовательность), сегмент центромерной области дрожжевой хромосомы и последовательности, образующиеся на обоих концах при линеаризации ДНК и действующие как теломеры, обеспечивающие стабильность хромосомы. При встраивании чужеродной ДНК в YAC может происходить нарушение рамки считывания маркерного дрожжевого гена. В результате продукт этого гена не образуется, и при выращивании клеток на специальной среде можно наблюдать цветную реакцию. Кроме того, некоторые YAC-векторы несут селективный маркер, независимый от сайта клонирования.

 







Дата добавления: 2015-09-04; просмотров: 1418. Нарушение авторских прав; Мы поможем в написании вашей работы!



Расчетные и графические задания Равновесный объем - это объем, определяемый равенством спроса и предложения...

Кардиналистский и ординалистский подходы Кардиналистский (количественный подход) к анализу полезности основан на представлении о возможности измерения различных благ в условных единицах полезности...

Обзор компонентов Multisim Компоненты – это основа любой схемы, это все элементы, из которых она состоит. Multisim оперирует с двумя категориями...

Композиция из абстрактных геометрических фигур Данная композиция состоит из линий, штриховки, абстрактных геометрических форм...

Виды сухожильных швов После выделения культи сухожилия и эвакуации гематомы приступают к восстановлению целостности сухожилия...

КОНСТРУКЦИЯ КОЛЕСНОЙ ПАРЫ ВАГОНА Тип колёсной пары определяется типом оси и диаметром колес. Согласно ГОСТ 4835-2006* устанавливаются типы колесных пар для грузовых вагонов с осями РУ1Ш и РВ2Ш и колесами диаметром по кругу катания 957 мм. Номинальный диаметр колеса – 950 мм...

Философские школы эпохи эллинизма (неоплатонизм, эпикуреизм, стоицизм, скептицизм). Эпоха эллинизма со времени походов Александра Македонского, в результате которых была образована гигантская империя от Индии на востоке до Греции и Македонии на западе...

Этапы трансляции и их характеристика Трансляция (от лат. translatio — перевод) — процесс синтеза белка из аминокислот на матрице информационной (матричной) РНК (иРНК...

Условия, необходимые для появления жизни История жизни и история Земли неотделимы друг от друга, так как именно в процессах развития нашей планеты как космического тела закладывались определенные физические и химические условия, необходимые для появления и развития жизни...

Метод архитекторов Этот метод является наиболее часто используемым и может применяться в трех модификациях: способ с двумя точками схода, способ с одной точкой схода, способ вертикальной плоскости и опущенного плана...

Studopedia.info - Студопедия - 2014-2024 год . (0.013 сек.) русская версия | украинская версия