Вставки ДНКПри конструировании рекомбинантных ДНК используют три источника ДНК-вставок: 1) геномная ДНК, фрагментированная либо с помощью физических методов, например, с помощью обработки ультразвуком, либо с помощью эндонуклеаз рестрикции; 2) синтетические фрагменты ДНК, полученные химическим или ферментативным методоми, либо при комбинировании этих методов; 3) фрагменты ДНК (кДНК), полученные с помощь обратной транскрипции in vitro. При гидролизе ДНК эндонуклеазами рестрикции часто образуются фрагменты, которые без дополнительной модификации можно использовать в виде вставки при создании рекомбинантной молекулы ДНК. В других случаях концы фрагментов ДНК, которые будут использованы как вставки, подвергают различным модификациям с помощью ферментов-инструментов. Вставки геномной ДНК. Под геномной ДНК подразумевается совокупность всех последовательностей ДНК данного организма, обеспечивающая полное воспроизведение его в потомстве. В клетках эукариот (например, животных или растений) ДНК находится в ядре клетки в составе хромосом (ядерная или - хромосомная ДНК), а также в некоторых клеточных органоидах - митохондриях и пластидах (митохондриальная и хлоропластная ДНК). В клетках прокариотических организмов (бактерий и архей) кольцевая или линейная молекула ДНК прикреплена изнутри к клеточной мембране. У прокариот, как и у низших эукариот (например, дрожжей), встречаются также небольшие автономные, преимущественно кольцевые, молекулы ДНК, называемые плазмидами. Кроме того, одно- или двухцепочечные молекулы ДНК могут образовывать геном ДНК-содержащих вирусов. Метод получения фрагментов ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикции отличается высокой воспроизводимостью. Специфические ферменты разрезают данную ДНК с образованием уникального набора фрагментов. При получении необходимого для работы фрагмента, находящегося в пуле продуктов рестрикции, необходимо провести обогащение смеси нужным фрагментом ДНК. С помощью методов электрофореза в полужидкой среде, а также жидкостной хроматографии высокого разрешения с обращенной фазой можно получить значительное обогащение смеси требуемым фрагментом ДНК. Следующим этапом является идентификация специфических фрагментов, которые часто называют ДНК-мишень или ДНК интереса.
|
