Лигирование по одноименным "липким" концам
Этот метод является самым распространенным и популярным. Впервые этим способом гибридная ДНК была получена С. Коэном с сотрудниками в 1973 году. Одноцепочечные концы, получаемые при гидролизе ДНК эндонуклеазами рестрикции, например EcoRI, образуют водородные связи с комплементарными им последовательностями другого конца этого же фрагмента или другого фрагмента ДНК. Таким образом, любые два фрагмента (независимо от их происхождения), образовавшиеся под действием одной и той же эндонуклеазы рестрикции, могут слипаться за счет образования водородных связей между комплементарными основаниями нуклеотидов однонитевых концевых участков (рис. 13). Однако, образование водородных связей между комплементарными основаниями одноцепочечных участков ДНК не восстанавливает полной целостности двойной спирали, поскольку остаются два разрыва в сахарнофосфатном остове полинуклеотидной цепи. Для восстановления фосфодиэфирных связей в полинуклеотидных цепях ДНК, т.е. для сшивания, или лигирования нитей, используют фермент ДНК-лигазу.
Рис. 13. Схема объединения фрагментов ДНК по липким и тупым концам (рестрикционно-лигазный метод).
Этот фермент в живой клетке выполняет ту же функцию - сшивание фрагментов ДНК, синтезирующихся при репликации.
|
