Студопедия Главная Случайная страница Обратная связь

Разделы: Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

ДНК-полимераза




Впервые ДНК-полимераза была выделена Корнбергом с сотрудниками в 1958 году из E.coli.

ДНК-полимераза I E.coli (Pol I) связывается с одноцепочечными участками двойной спирали ДНК, в местах одноцепочечных разрывов с З'-гидроксилом и 5'-фосфатом, а также с концами двухцепочечных молекул ДНК.

Фермент состоит из мономерной полипептидной цепи с молекулярной массой 103 кДа и имеет 3-х доменную структуру. Каждый домен обладает своей ферментативной активностью: 5’→3’ полимеразной, 3’→5’ экзонуклезной, 5’→3’ экзонуклеазной (рис. 7).

 

Рис. 7. ДНК-полимераза I E. coli: А) структура, Б) модель взаимодействия с молекулой ДНК

1. 5'→3' полимеразная активность. Для реакции необходимо наличие одноцепочечной ДНК-матрицы и комплементарного участку этой цепи фрагмента — праймера (затравки) с З'-ОН концом (рис. 8).

 

Рис. 8. Схема, демонстрирующая 5'→3' полимеразную активность ДНК-полимеразы I E.coli

 

2. 3'→5' экзонуклеазная активность. Гидролизует одноцепочечную или двухцепочечную ДНК с З'-ОН конца. 3'→5' нуклеаза расщепляет диэфирную связь только в неспаренных участках ДНК (рис. 9). Известно, что при полимеразной реакции с определенной частотой возможно включение в растущую цепь некомплементарного нуклеотида. Однако полимераза не может присоединять нуклеотид к неправильно спаренному концу, образовавшемуся при ее участии. На помощь приходит 3'→5' экзонуклеаза, убирающая ошибочный нуклеотид, на место которого затем присоединяется правильный нуклеотид-предшественник. рассматриваемая 3'→5' экзонуклеолитическая активность проявляется в направлении, обратном синтезу ДНК (5'→3'). Таким образом, 3'→5' экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы играет важную роль в точности полимеризации, направляемой матрицей. Эффективность, или число оборотов, данной экзонуклеазы в оптимальных условиях составляет 2% от числа оборотов субъединицы с полимеразной активностью.

 

Рис. 9. Схема, демонстрирующая 3'→5'-экзонуклеазную активность ДНК-полимеразы I E.

3. 5'→3' экзонуклеазная активность гидролизует одну цепь двухцепочечной ДНК, начиная со свободного 5'-конца. В отличие от 3'→5' экзонуклеазы 5'→3' экзонуклеаза расщепляет диэфирную связь только в спаренных участках двухцепочечной молекулы ДНК. Более того, в то время как 3'→5' нуклеаза отщепляет за одну реакцию только один нуклеотид, 5'→3' нуклеаза может вырезать с 5'- конца олигонуклеотиды длиной до десяти остатков. Скорость нуклеазного отщепления увеличивается на порядок при одновременно протекающей реакции полимеризации. При этом увеличивается относительное количество олигонуклеотидов в продуктах гидролиза ДНК.

Такое сочетание ферментативных активностей позволяет ДНК-полимеразе I E. coli играть активную роль не только при репликации запаздывающей нити ДНК, но и в репарации повреждений ДНК in vivo. N - концевой домен ДНК-полимеразы I соединен с соседним участком молекулы петлей из аминокислотных остатков, которая расщепляется протеолитическим ферментом. Оставшаяся часть бифункциональна, так как состоит из полимеразы и 3’→5’ экзонуклезы. Она названа фрагментом Кленова (по фамилии одного из авторов, описавших ее). Реакции, катализируемые ДНК-полимеразой I, нашли широкое применение при исследовании природных ДНК, а также при создании рекомбинантных структур методами генетической инженерии:

· достраивание одноцепочечных 5'-концов на двухцепочечной ДНК, часто генерируемых эндонуклеазами рестрикции, до тупых (рис. 9);

· синтез второй цепи на одноцепочечной ДНК (рис. 8);

· гидролиз одноцепочечных З'-концов на двухцепочечных молекулах ДНК (рис. 9);

· получение меченых ДНК-зондов (метод ник-трансляции) с высокой удельной активностью (рис. 10).

Рис. 10. Схема осуществления ник-трансляции с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I E.coli

При методе ник-трансляции ДНК-полимераза I, выступая в роли экзонуклеазы, осуществляет деградацию цепи ДНК в 5'→3' направлении, начиная с 5'-конца одноцепочечной бреши (ника) в двухцепочечной ДНК, а выступая в роли полимеразы, восстанавливает цепь путем последовательного присоединения мононуклеотидных остатков к свободной 3'-гидроксильной группе на другом конце бреши. На самом деле происходит перемещение бреши, которое получило название ник-трансляции.







Дата добавления: 2015-09-04; просмотров: 602. Нарушение авторских прав


Рекомендуемые страницы:


Studopedia.info - Студопедия - 2014-2020 год . (0.002 сек.) русская версия | украинская версия