Студопедия Главная Случайная страница Обратная связь

Разделы: Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

Лигирование по одноименным "липким" концам с обработкой щелочной фосфатазой




При лигировании двух фрагментов ДНК, один из которых является линеаризованным вектором (см. раздел векторы), а другой – донорной ДНК, содержащей нужный фрагмент ДНК и предварительно обработанной такой же эндонуклеазой как и вектор, целесообразно применить еще один фермент-инструмент: щелочную фосфатазу. Чтобы предупредить комплементарное взаимодействие между липкими концами одного и того же типа рестрицированных фрагментов, например – линеаризованного вектора, проводят обработку фосфатазой, которая отщепляет фосфатные группы на 5’-концах одноцепочечных липких концов. ДНК-лигаза не может сшить концы дефосфорилированной линейной векторной ДНК (рис. 14).

 

Рис. 14 . Встраивание чужеродной ДНК в плазмидный вектор.

Плазмидную ДНК, обработанную эндонуклеазой рестрикции и щелочной фосфатазой, смешивают с рестрицированной донорной ДНК, содержащей нужный ген, и добавляют ДНК-лигазу. Два из четырех одноцепочечных разрыва при этом устраняются, и конструкция оказывается стабильной благодаря образовавшимся фосфодиэфирным связям

 

Что касается собственно рекомбинантных молекул ДНК, то хотя в них и имеются два одноцепочечных разрыва, ее фрагменты удерживаются вместе двумя фосфодиэфирными связями, образовавшимися с помощью ДНК-лигазы между дефосфорилированной плазмидной ДНК и рестрицированной донорной ДНК (рис. 14). При репликации этой ДНК после введения ее в клетку-реципиент одноцепочечные разрывы устраняются системой лигирования клетки-хозяина.

 







Дата добавления: 2015-09-04; просмотров: 548. Нарушение авторских прав


Рекомендуемые страницы:


Studopedia.info - Студопедия - 2014-2020 год . (0.002 сек.) русская версия | украинская версия