Лигирование по одноименным "липким" концам с обработкой щелочной фосфатазой
При лигировании двух фрагментов ДНК, один из которых является линеаризованным вектором (см. раздел векторы), а другой – донорной ДНК, содержащей нужный фрагмент ДНК и предварительно обработанной такой же эндонуклеазой как и вектор, целесообразно применить еще один фермент-инструмент: щелочную фосфатазу. Чтобы предупредить комплементарное взаимодействие между липкими концами одного и того же типа рестрицированных фрагментов, например – линеаризованного вектора, проводят обработку фосфатазой, которая отщепляет фосфатные группы на 5’-концах одноцепочечных липких концов. ДНК-лигаза не может сшить концы дефосфорилированной линейной векторной ДНК (рис. 14).
Рис. 14. Встраивание чужеродной ДНК в плазмидный вектор. Плазмидную ДНК, обработанную эндонуклеазой рестрикции и щелочной фосфатазой, смешивают с рестрицированной донорной ДНК, содержащей нужный ген, и добавляют ДНК-лигазу. Два из четырех одноцепочечных разрыва при этом устраняются, и конструкция оказывается стабильной благодаря образовавшимся фосфодиэфирным связям
Что касается собственно рекомбинантных молекул ДНК, то хотя в них и имеются два одноцепочечных разрыва, ее фрагменты удерживаются вместе двумя фосфодиэфирными связями, образовавшимися с помощью ДНК-лигазы между дефосфорилированной плазмидной ДНК и рестрицированной донорной ДНК (рис. 14). При репликации этой ДНК после введения ее в клетку-реципиент одноцепочечные разрывы устраняются системой лигирования клетки-хозяина.
|
