Студопедия Главная Случайная страница Обратная связь

Разделы: Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

Лигирование фрагментов с разноименными липкими, или липким и тупым концами




В ситуациях, когда необходимо сшить фрагменты ДНК, образованные разными эндонуклеазами рестрикции, и имеющие разные, то есть некомплементарные друг другу липкие концы, или тупой и липкий концы применяют адаптеры (to adapt – переделывать) или линкеры (to link – связывать). Это молекулярные "переходники". Адаптер представляет собой синтетический двухцепочечный олигонуклеотид с одним тупым концом и одним липким (рис. 16). После пришивания адаптера тупым концом к фрагменту ДНК на конце последнего появляется липкий конец для сшивания с комплементарным ему концом другого фрагмента. Впервые эту идею предложил Шеллер с сотрудниками в 1977 году.

Синтезированы большие наборы таких генных "переходников". Естественно, что при использовании линкеров должна учитываться необходимость соблюдения правил экспрессии генетической информации. Часто в середину линкера помещают какой-либо регуляторный генетический элемент, например, нуклеотидные последовательности промотора или последовательности, соответствующие участку связания с рибосомой. В этом случае линкеры обеспечивают не только объединение генов, но и обуславливают их экспрессию. Существуют линкеры "тупой конец - липкий конец", “липкий – липкий” и “липкий – тупой” (рис. 16).

 

 

Рис. 16. Изменение концов фрагментов ДНК с помощью различных адаптеров: “тупой – липкий” (1); “липкий – липкий” (2); “липкий – тупой” (3).

 

 

При необходимости липкие концы можно превратить в тупые. Это достигается либо отщеплением липких концов с помощью фермента - эндонуклеазы S1, которая разрушает только одноцепочечную ДНК, либо липкие концы "застраивают", то есть с помощью ДНК-полимеразы I на однонитевых липких концах синтезируют вторую нить (рис.17)

 

 

Рис. 17. Преобразование липких концов рестрикционных фрагментов ДНК в тупые.

 

Линкеры, содержащие участки узнавания для нескольких эндонуклеаз рестрикции, называются полилинкерами или множественными сайтами клонирования (MCS – multiply cloning sites). Они будут рассмотрены в следующей главе.

 

 







Дата добавления: 2015-09-04; просмотров: 364. Нарушение авторских прав


Рекомендуемые страницы:


Studopedia.info - Студопедия - 2014-2020 год . (0.002 сек.) русская версия | украинская версия