Секвенирование ДНК

Исчерпывающую информацию о молекуле ДНК можно получить, только определив ее нуклеотидную последовательность. Эта процедура называется секвенированием (от англ. sequence). Так, секвенировав ген, т.е. установив последовательность нуклеотидов определенного участка ДНК, часто удается установить его функцию, сравнив эту нуклеотидную последовательность с таковыми для генов, функция которых уже известна. Без данных о нуклеотидной последовательности невозможно проводить исследования по молекулярному клонированию, а также создание экспрессионных рекомбинантных ДНК.

Работы по секвенированию ДНК довольно дорогостоящие. Они требуют специального прецизионного оборудования, особо чистых химических реактивов и биологических препаратов, а также специалистов с высокой профессиональной подготовкой. Потенциал биотехнологии будет реализован в полной мере только тогда, когда ее инструментарий (в том числе и секвенирование геномов) станет столь же доступным и недорогим, как персональные компьютеры. Чтобы снизить стоимость процедуры секвенирования, разработчики новых методов стараются сократить число подготовительных этапов, до предела миниатюризировать оборудование и проводить секвенирование миллионов молекул одновременно

Прежде, чем приступить к описанию методов секвенирования, следует вспомнить основные моменты воспроизведения нуклеотидных последовательностей ДНК, т.е. некоторые принципиальные этапы репликации ДНК.

ДНК клетки, приступающая к делению, претерпевает кардинальные изменения: двойная спираль раскручивается, цепи расходятся. На каждой цепи начинается синтез комплементарных полинуклеотидов, на одной — непрерывный, на второй прерывистый. Его катализирует фермент под названием ДНК-зависимая ДНК-полимераза; другой фермент, ДНК-лигаза, сшивает полинуклеотидные фрагменты в непрерывную цепь. Так из одной молекулы ДНК образуются две.

Многие методы секвенирования ДНК основаны на взаимной комплементарности цепей этой молекулы. Генетический алфавит состоит всего из четырех букв — азотистых оснований аденина (А), цитозина (С), гуанина (G) и тимина (Т). Основания противоположных цепей молекулы ДНК соединяются в соответствии с правилом комплементарности: А образует пару с Т, а С — с G. В результате такого взаимодействия образуется хорошо известная двойная спираль — структура, напоминающая винтовую лестницу (рис. 34).

Рис. 34. Схема синтеза дочерних нуклеотидных цепей на обеих цепях ДНК

Живые организмы используют принцип комплементарности при копировании своего генетического материала (репликация) и устранения повреждений в нем (репарация). Он же лежит в основе амплификации (см. ПЦР) целевых фрагментов ДНК и их последующего секвенирования с помощью метода, разработанного в конце 1970-х гг. Ф. Сангером.