На первых двух стадиях колоночной хроматографии пустую колонку наполняют суспензией твердой фазы в жидкой. На третьей происходит оседание твердой фазы, на которую на четвертой стадии наносят образец. На последующих стадиях происходит разделение компонентов образца, собираемых в разные фракции, на последней стадии колонку отмывают от остатков образца для нового использования.
Для набивки колонок твердой фазой существует два основных метода, сухой и мокрый. В первом случае колонку сначала наполняют сухим порошком, после чего пропускают подвижную фазу (жидкость или газ). Во втором случае колонку наполняют суспензией наполнителя в подвижной фазе. Если подвижная фаза является жидкой, то в обоих случаях следует предусмотреть отсутствие пузырей воздуха в готовой колонке, что может повлиять на качество хроматографии или полностью ее блокировать. Всегда существует опасность выхода колонки из строя в результате попадания в нее недопустимых веществ (нерастворимые вещества или слишком активные молекулы, забивающие канал колонки), не устранённых при пробоподготовке.
В качестве твердой фазы могут быть использованы: силикагель, оксид алюминия, микрокристаллическая целлюлоза, агароза. В процессе хроматографии отдельные компоненты нанесенной на колонку смеси выходят из нее с различной скоростью. Их собирают по фракциям, определяя концентрацию ожидаемых веществ в каждой фракции. Окрашенные вещества кроме того могут быть видны через стеклянные стенки колонки.
