Хроматография. Хроматография - это совокупность методов разделения и анализа смесей веществ, основанных на различном распределении компонентов между подвижной (газ или
Хроматография - это совокупность методов разделения и анализа смесей веществ, основанных на различном распределении компонентов между подвижной (газ или жидкость) и неподвижной (жидкость, твердый сорбент или их смесь) фазами хроматографической системы. Хроматографическое разделение смеси аналитов основано на разнице скоростей перемещения масс различных веществ, растворенных в подвижной фазе и протекающих сквозь стационарную фазу. Компоненты образца биоматериала движутся через хроматографическую систему только тогда, когда они находятся в подвижной фазе. Разделение зависит от разной степени физического взаимодействия веществ со стационарной фазой. Вещество, более сродственное со стационарной фазой, продвигается более медленно через систему, чем вещество, более сродственное с подвижной фазой. Характеристики подвижной и стационарной фаз, характеристики аналитов в подвижной фазе, характеристики пористой среды, динамика потока - определяют скорости прохождения отдельных веществ через хроматографическую систему и разделение их. Старейшей формой хроматографии была поверхностно-адсорбционная - жидкостно-твердофазная. Русский ученый Цвет в 1906 г. использовал колонку карбоната кальция для разделения растительных пигментов на ряд окрашенных полос (отсюда и возникло название метода). В основе механизма поверхностно-адсорбционной хроматографии лежат электростатические, водородные, дисперсионные взаимодействия. В газовой хроматографии осуществляется анализ низкомолекулярных веществ (метилового, этилового и изопропилового спиртов, а также таких газов, как кислород, азот, углекислый газ) с помощью так называемых «молекулярных сит», алюминия. В жидкостном варианте хроматографии используются три типа адсорбентов. К неполярной группе относятся древесный уголь и полистирен-дивинил бензен. Алюминий выступает в роли полярного адсорбента со свойствами основания. Подвижная фаза и растворенные вещества конкурируют за связывающие участки стационарной фазы в соответствии с собственной силой растворения и свойствами (основными, кислыми, нейтральными) стационарной фазы. Поверхностно-адсорбционный принцип хроматографии относительно редко применяется в клинической аналитике. Принцип распределительного варианта хроматографии основан на различиях растворимости молекул растворяемого вещества в двух несмешивающихся жидкостях, которые соприкасаются друг с другом (жидкостно-жидкостная хроматография. В ионообменной хроматографии отделение искомого вещества из исследуемой пробы, содержащей смесь, происходит на основе различий знака и величины ионного заряда неорганических ионов, аминокислот, белков, нуклеотидов. Катионобменная смола имеет много отрицательно заряженных ковалентно связанных функциональных групп. Эти группы окружены катионами (например, Na+), которые способны обмениваться с катионами растворенного вещества. Анионобменная смола обладает сильноосновными четвертичными аминами (триэтиламиноэтиловые группы) или слабоосновными группами (аминоэтил, диэтиламиноэтил и др.), которые могут создавать положительный заряд. Окружающие их анионы (например, ОН-) легко обмениваются с анионами исследуемого раствора. Ион-обменная хроматография применяется при скрининге свинцовой интоксикации ручном методе определения 5 - аминолевулиновой кислоты и порфобилиногена в моче. Механизмы стерической эксклюзивной хроматографии (гельфильтрации, хроматографии на «молекулярном сите») основаны на различиях размеров молекул, а также их формы и степени гидратации. Стационарной фазой служат образующие гель гидрофильные материалы в форме мелких шариков, в том числе перекрестно-связанный декстран (Сефа-декс), полиакриламид, агароза (Сефароза). Микрошарики имеют пористую структуру, содержат микроканалы и отверстия. Задавая в процессе производства этих материалов определенный размер каналов и пор, можно сформировать стационарную фазу, избирательную для молекул соответствующего размера, которые способны задержаться в этих порах. Более крупные молекулы проходят вдоль колонки, и, не будучи способными задерживаться, первыми попадают в элюат. Возможность использования в качестве стационарной фазы гидрофобных материалов (полистиреновые шарики метилированного сефа-декса, перекрестно-связанный полиметилакрилат) позволяет применять этот вид хроматографии для разделения веществ, растворимых только в органических растворителях (триглицериды, жирные кислоты). Гельфильтрация может быть заменой диализа при освобождении растворов, содержащих белок, от солей. Понятие «аффинная хроматография» охватывает множество механизмов разделения веществ, основанных на специфических взаимодействиях между соединениями (фермент-субстрат, гормон-рецептор, антиген-антитело). В качестве стационарной фазы используется молекула, связанная с инертным носителем, т. е. лиганд. При строго определенных условиях (величина рН, ионная сила) обеспечивается связывание аналита с лигандом. Высвобождение аналита, т. е. его элюирование, достигается либо добавлением специфического агента (например, ингибитора или субстрата фермента), либо изменением рН или ионной силы, либо воздействием так называемого хаотропного реагента, т. е. способного разрывать водородные связи (мочевина, сульфат, гуанин гидрохлорид). Этот вариант хроматографии может использоваться как для подготовительной стадии анализа, так и при выделении изучаемого аналита (например, гликированного гемоглобина) от других его форм. Бумажная хроматография основана на использовании в качестве стационарной фазы различных сортов фильтровальной бумаги, подбираемых по степени гомогенности, толщине, доле примесей, скорости движения подвижной фазы. Этот относительно дешевый и быстрый способ разделения, однако, используется в клинико-лабораторной практике довольно редко. Технологически близкой к бумажной хроматографии является тонкослойная хроматография, где носителем является тонкий (0,2 мм толщины) слой сорбента (силикагель, микроцеллюлоза, алюминий, сефа-декс и др.), нанесенный на стеклянную или пластиковую пластинку. Проба наносится на этот слой в виде пятна поблизости от одного из краев пластинки. Этим краем пластинка в наклонном положении помещается в сольвент, подобранный в качестве мобильной фазы. В закрытом контейнере сольвент, благодаря капиллярному действию, движется вверх по слою сорбента, увлекая из пятна пробы разделяемые вещества. При достижении фронтом сольвента определенной высоты пластинка извлекается из контейнера, высушивается. Высушенная пластина может быть подвергнута хроматографической процедуре повторно путем помещения в другой сольвент под углом 90°. При этом пятна смесей веществ, не разделенных при разгонке в одном направлении, могут быть разделены. Детекция пятен искомых веществ осуществляется путем ультрафиолетового облучения, опрыскивания пластинки специфическим окрашивающим раствором, с помощью ауторадиографии. Для количественного определения пятно изучаемого вещества может быть снято и экстрагировано. На мировом рынке представлены гель-трансиллюминаторы - устройства для автоматизированного просмотра пластин геля (например, агарозы) после проведенного электрофореза или тонкослойной хроматографии, регистрации результатов в графической и цифровой формах. В программе компьютера заложены возможности юстировки прибора с учетом различных красителей. Полученные изображения полос разделенных веществ могут быть сохранены на дискете для архива данных. С помощью газовой хроматографни происходит разделение веществ, находящихся в газообразной форме, при движении подвижной фазы над стационарной фазой. Стационарная фаза может быть представлена твердым веществом с большой поверхностной зоной или нелетучей жидкостью, покрывающей твердый носитель. Этот последний, газо-жидкостный вариант, используется в клинической аналитике. Подвижную фазу образует инертный газ (азот, гелий, аргон), который переносит исследуемую пробу сквозь колонку. На выходе из колонки устанавливается детектор, который улавливает элюируемые с колонки компоненты и регистрирует их в виде пиков на результирующем графике. Положение максимума пика используется для идентификации вещества. Высота пика или площадь под его контуром служит для количественной оценки компонента. Процесс газовой хроматографии осуществляется в специальных приборах - газовых хроматографах. Колонки для газовой хроматографии изготавливают из стекла или из нержавеющей стали. Каждый из этих материалов имеет свои достоинства и недостатки: стальные дешевы и прочны, их поверхность не обладает адсорбционными свойствами, они имеют высокую теплопроводность. Однако некоторые вещества могут вступать в реакцию с металлом (холестерин, галогены). Стеклянные колонки позволяют визуально контролировать полноценность загрузки колонки и наличие нелетучих остатков. Однако эти колонки хрупки, требуют дезактивации активных участков внутри колонки. Наименьший внутренний диаметр и наибольшую длину имеют капиллярные колонки. Они нужны для разделения очень близких изомеров (углеводородов, ароматических соединений). Наиболее популярным вариантом жидкостной хроматографии в клинической аналитике является так называемая высокопроизводительная жидкостная хроматография (ВПЖХ), выполняемая в соответствующих устройствах, обладающих многокомпонентной структурой, - жидкостных хроматографах. Детекция разделенных компонентов осуществляется в жидкостных хроматографах с помощью проточных фотометрических, флюорометрических или электрохимических устройств. Результаты разделения компонентов регистрируются графически в виде хроматограммы или могут быть рассчитаны с помощью цифрового интегратора. Разнообразие видов хроматографии: - газовая (подвижная фаза - газ), газо-жид костная (подвижная фаза - газ, неподвижная - жидкость), жидкостная (обе фазы - жидкости), - позволяет осуществлять разделение широкого круга аналитов: газов, неорганических ионов; аминокислот, сахаров, жиров, витаминов, медикаментов, стероидов; макромолекулярных веществ - белков, полисахаридов, нуклеиновых кислот, растворимых вирусов; субклеточных компонентов, бактерий. Вследствие этого хроматография как мощное аналитическое средство для разделения, детекции и количественной оценки может довольно широко применяться в клинической лабораторной аналитике. Фотометрические методы исследования Многие определения в клинической лабораторной диагностике основаны на измерении лучистой энергии, испускаемой, поглощаемой, рассеиваемой или отражаемой в определенных условиях. Клиническая лабораторная диагностика оперирует узким диапазоном лучистой энергии, чаще всего видимым светом, реже ультрафиолетовым и инфракрасным. Фотометрия-измерение количества поглощаемого света, независимо от длины волны. В КЛД практически используются только узкие полосы-определенные диапазоны длин волн, веделенные с помощью светофильтров (фильтровые фотометры) или с помощью более сложных устройств-призм или решеток или их комбинацией (спектрофотометры). Фотоэлектроколориметры (колориметры), фотометры, спектрофотометры, нефелометры, флуориметры, турбидиметры, рефрактометры, хемилюминометры и построенные на их основе специализированные приборы и анализаторы образуют класс фотометрических приборов. Таблица 1 Цветовые зоны видимого спектра
Своим названием этот класс приборов обязан фотометрическому принципу детектирования•результата: измерение энергии светового потока с помощью фотодетекторов, преобразующих световую энергию в электрический сигнал.
|
