Проведение эксперимента
При исследовании кинетики пероксидазного окисления йодид-ионов за ходом реакции наблюдают по изменению концентрации образующегося йода, измеряемой спектрофотометрически при длине волны l = 400 нм. Реакцию проводят непосредственно в кювете измерительного прибора-спектрофотометра. Объем реакционной смеси постоянен во всех измерениях и составляет 4 мл. Перед началом опыта в соответствии с инструкцией к измерительному прибору проводят подготовительные операции, необходимые для измерения оптической плотности исследуемых растворов. В кювету заливают буферный раствор, заданные объемы растворов йодистого калия и пероксидазы и помещают ее в кюветное отделение спектрофотометра (фотоколориметра). Ферментативную реакцию начинают внесением с помощью дозатора необходимого объема пероксида водорода. Измерения оптической плотности реакционной смеси проводят в соответствии с инструкцией к используемому измерительному прибору. Продолжительность опыта 5 – 10 минут. Затем кювету промывают водой и заливают в нее новые растворы для следующего опыта. Опыты проводят при пяти различных концентрациях субстрата (KI или H2O2) и постоянной концентрации второго субстрата. Для определения эффективных значений константы Михаэлиса и максимальной скорости по йодиду калия необходимо провести измерение начальной скорости пероксидазной реакции с различными концентрациями йодида калия при постоянной концентрации второго субстрата – пероксида водорода и фермента. Состав растворов приведен в таблице III.1. Растворы готовить, сливая реагенты в следующей последовательности:
Таблица III.1. Состав растворов для определения эффективных значений константы Михаэлиса и максимальной скорости по йодиду калия
Для определения эффективных значений константы Михаэлиса и максимальной скорости по пероксиду водорода необходимо провести измерение начальной скорости реакции с различными начальными концентрациями пероксида водорода при постоянстве концентрации KI. Состав растворов приведен в таблице III.2. Последовательность сливания реагентов та же.
Таблица III.2. Состав растворов для определения эффективных значений константы Михаэлиса и максимальной скорости по H2O2.
Для определения истинной константы скорости (
|
) одной из стадий пероксидазной реакции (схема III.5) необходимо определить эффективные константы Михаэлиса по пероксиду водорода при разных начальных концентрациях второго субстрата – KI. Состав реакционных смесей для проведения опытов приведен в приложении в таблице III.7.
