Прямой визуальный метод

Определение фагоцитарной активности гранулоцитарных клеток является неотъемлемой частью тестов при определении иммунного статуса, поскольку фагоцитоз является одним из главных звеньев неспецифического иммунитета.

Растворы и реактивы.

Для проведения анализа необходимо:

Фиксатор – 1 часть краски Романовского-Гимза и 3 части этилового спирта 96˚. Краска – 1 часть краски Романовского-Гимза и 2 части дистиллированной воды. Взвесь пекарских дрожжей – свежие дрожжи разводят в физ.растворе в соотношении 1:5 и выдерживают на водяной бане в течении 1 часа, охлаждают и хранят в холодильнике. Перед постановкой теста готовят рабочее разведение дрожжей: отмывают дрожжи физ.раствором до получения прозрачной надосадочной жидкости. Из осадка готовят 1% взвесь дрожжей.

Постановка реакции.

1. 50 мкл 1% дрожжей смешивают с 50 мкл гепаринизированной крови в круглодонном иммунологическом планшете, инкубируют в термостате при 37˚С 30 минут.

2. Делают мазок из содержимого лунок планшета. Приготовление мазка – 20 мкл пробы наносят на предметное стекло, равномерно распределяют по всей поверхности, высушивают на воздухе, фиксируют 20 минут и окрашивают.

3. В мазке через 30 минут подсчитывают количество фагоцитирующих нейтрофилов из 100 подсчитанных и количество поглощенных ими объектов.

Учет реакции.

Оценка фагоцитарной активности нейтрофилов осуществляется по трем показателям.

ФП (фагоцитарный показатель) – число фагоцитирующих нейтрофилов на 100 подсчитанных нейтрофилов через 30 минут инкубации.

ФЧ (фагоцитарное число) определяется путем деления количества поглощенных дрожжевых клеток на число «активных» (поглотивших дрожжи) нейтрофилов через 30 минут инкубации, что соответствует среднему числу дрожжевых клеток, поглощенных одним активным нейтрофилом.

КАФ (коэффициент активных фагоцитов) – интегральный показатель активности фагоцитарной системы, выражающийся в абсолютном количестве фагоцитирующих нейтрофилов, рассчитывается, исходя из общего количества лейкоцитов, % содержания нейтрофилов и ФП.