ХЛ метод оценки бактерицидной способности фагоцитов

 

Также для определения бактерицидной способности фагоцитов используется хемилюминесцентный метод, предложенный сравнительно недавно.

Немаловажным аспектом ХЛ-анализа является качество подготовки суспензии фагоцитов. Известно, что ХЛ ответ крови определяется в основном фагоцитирующими клетками: нейтрофилами, моноцитами и макрофагами, способными продуцировать АФК (супероксидный радикал (О₂^-), перекись водорода (Н₂О₂), гидроксильный радикал (ОН) и др.). Наибольший уровень АФК определяется, прежде всего, нейтрофилами. ХЛ анализ проб цельной крови следует проводить в течение двух часов после забора крови. Для хранения крови необходимо использование пробирок из полиэтилена, что препятствует адгезии гранулоцитов на стенки пробирок, которая повышает активацию клеток. При регистрации ХЛ нейтрофилов крови рекомендуется использовать конечную концентрацию люминола от 10^-5 до 10^{-4 М. Для устранения нежелательных примесей, влияющих на показатели ХЛ-реакции ПМЯЛ, достаточно одной отмывки клеток раствором Хенкса. При этом обеспечивается достаточное сохранение жизнеспособности клеток. Как известно, фагоцитоз нейтрофилами и макрофагами сопровождается генерацией активных форм кислорода (О}₂-, Н₂О₂, ОН-), что сопровождается сверхслабым свечением – хемилюминесценцией. Последняя пропорциональна интенсивности генерации фагоцитами активных форм кислорода и может служить косвенным критерием их фагоцитарной способности, тем более что образуемые продукты обладают выраженными бактерицидными свойствами. Интенсивность ХЛ нейтрофилов обычно составляет менее 1 фотона в 1 секунду на клетку. Для повышения интенсивности ХЛ-свечения нейтрофилов используют активаторы ХЛ – люминофоры. Используют такие люминесцирующие химические реагенты, как люминол (5-амино-2,3-дигидро-1,4-фталоазинодион), люцигенин, а также различные аналоги люминола (3-12-диамино-винил)-фталгидрозид, бензолфталазин-1,4(2Н, 3Н)-дион и др. В последнее время, по данным литературы для изучения фагоцитарной активности лейкоцитов используют именно люминолзависимую ХЛ. Выбор люминола в качестве активатора свечения нейтрофилов основан на его высокой активности (свечение клеток в присутствии люминола усиливается в 10³-10⁴ раз), относительно низкой стоимости, стабильности и нетоксичности реактива. Среди методов, регистрация хемилюминесценции является наиболее чувствительным и информативным методом функциональной оценки фагоцитирующих клеток, но вместе с тем и одним из наиболее сложных, не столько в методическом плане, сколько в понимании природы биохимических и физических процессов, которые приводят к излучению света. Механизмы, лежащие в основе ХЛ фагоцитов, сложны и недостаточно изучены. Свечение может возникать в реакции O₂+O₁=2O₂+hν, важную роль могут играть радикалы ОН-. Анализ различных ингибиторов свечения приводит к мысли, что синглетный кислород, гидроксильный радикал и перекись водорода вовлечены в процесс ХЛ. ХЛ фагоцитирующих клеток значительно усиливается в присутствии люминола или люцигенина. Предложено много методов регистрации ХЛ фагоцитарных клеток, эти методы можно разделить на 2 основных класса.

· Регистрация собственной ХЛ. Усиление собственной ХЛ фагоцитирующих клеток наблюдается при стимуляции опсонизированным зимозаном, бактериями, частицами латекса. Собственная ХЛ клеток имеет низкую интенсивность и лежит в широком спектральном диапазоне с максимумом в области 400 – 500 нм. Регистрация ХЛ требует высокой чувствительности прибора и достаточного количества выделения клеток (обычно не менее 10⁶ клеток). Эритроциты, гемоглобин, сыворотка крови ингибируют ХЛ.

· ХЛ в присутствии люминола. Свечение имеет на 2 – 3 порядка большую интенсивность, чем собственная ХЛ. Усиление ХЛ наблюдается при действии зимозана, бактерий, частиц латекса, комплексов антиген – антитело, ионофора кальция, хемотаксических пептидов. ХЛ может наблюдаться в суспензии как выделенных, клеток, так и клеток в сыворотке крови.

Таким образом, хемилюминесцентный метод позволяет проводить быструю количественную оценку фагоцитарной и бактерицидной активности клеток. Он может использоваться при исследовании малых количеств биологического материала крови, или может служить как для оценки состояния клеток, так и для оценки опсонической активности сыворотки и влияния лекарственных препаратов.

ХЛ метод позволяет определить бактерицидную способность фагоцитов. Данный тест ставился в двух вариантах – спонтанном и стимулированном. Спонтанный тест позволяет оценить состояние кислородзависимого механизма бактерицидности гранулоцитов. Стимулированный тест позволяет оценить функциональный резерв кислородзависимого механизма бактерицидности гранулоцитов.

Реактивы и их приготовление.

3% желатин (AppliChem) – к 0,6 г желатина прибавляем 20 мл PBS, нагреваем на водяной бане до полного растворения.

Опсонизированный зимозан А (Sigma). Зимозан опсонизируют донорской сывороткой:

· 100 мг зимозана растворяем 5 мл донорской сыворотки

· помещаем в термостатируемый шейкер на 1 час при 37°С

· центрифугируем 1500 об/мин – 10 мин

· надосадок аккуратно пипеткой сливаем

· 3 раза отмываем раствором PBS

· разводим в 5 мл PBS

Замораживаем.

В качестве донорской используем сливную сыворотку.

Люминол (Sigma)

· 10 мг люминола растворить в 100 мл раствора PBS

выдержать в течение 18 часов раствор в холодильнике

· перемешиваем на шейкере в течение 1 часа

· отфильтровываем через бумажный фильтр

Замораживаем.

Повторному замораживанию ни зимозан, ни люминол не подвергать.

PBS (Sigma) – 1 таблетка PBS на 100 мл физиологического раствора.

Выделение нейтрофилов.

Кровь собирают в стеклянные пробирки (200 мкл гепарина + 2 мл крови)

· 2 мл крови: 1 мл 3% желатина (слегка перемешать пипеткой)

· в термостат на 10-20 мин при 37°С

параллельно с пробирками с кровью ставим пробирки с PBS (по 2 мл) для поддержания в них необходимой температуры

· в термостате происходит расслоение

собираем верхний слой (сколько будет) и помещаем в пробирки с PBS

· центрифугируем 10 мин при 1000 об/мин

· надосадок сливаем (через край пробирки)

· осадок аккуратно перемешиваем пипеткой

Необходимо чтобы в пробе было 2млн клеток.

Рассчитываем кол-во PBS, которым необходимо ресуспендировать взвесь лейкоцитов для получения 2млн клеток, при условии, что при выделении теряется около 50% клеток.

Расчет ведем по выведенной формуле:

Vмл = 0,25*кол-во лейкоцитов крови*NE(%)*Vкрови, идущей на выделение.

Постановка реакции.

В лунки:

o в каждую по 100 мкл пробы

o во второй ряд планшета по 10 мкл опсонизированного зимозана

Планшет помещаем в термостат на 2-3 минуты при 37ºС, а также, параллельно с планшетом пробирки с люминолом.

o в каждую по 100 мкл люминола

Регистрация хемилюминесценции фагоцитов была проведена на многорежимном детекторе Anthos Zenyth 1100 в непрозрачном стриппированном по 12 лунок планшете для люминесцентных анализов. Измерение люминесценции проводилось 10 раз через каждые 138 секунд.

Учет реакции.

Уровни спонтанной и стимулированной активности нейтрофилов учитываем по максимальному значению ХЛ свечения. А так же рассчитываем коэффициент стимуляции.

КС = СтАН / СпАН.

 

Список использованной литературы

1. Воробьев А.А., Быков А.С., Караулов А.В. Иммунология и аллергология: Практическая медицина, 2006г. – 288с.: ил.

2. Галактионов В.Г. Иммунология: – 3-е издание, исправленное и дополненное – М.: «Академия», 2004. – 528 с.

3. Долгушин И.И., Бухарин О.В. Нейтрофилы и гомеостаз. – Екатеринбург: изд-во УРО РАН, 2001. – 277 с.

4. Кишкун А.А. Руководство по лабораторным методам диагностики. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. – 800 с.

5. Козлова С.И., Демикова Н.С.. Семанова Е., Блинникова О.Е. Наследственные синдромы и медико-генетическое консультирование. – М., 1996. – С. 311.

6. Лифшиц В.М., Сидельникова В.И. «Лабораторные тесты при заболеваниях человека». Справочник для врачей. – М., «Триада-Х», 2003. – 352с.

7. Маршалл В.Дж. Клиническая биохимия: Пер. с англ. – М.; СПб.: БИНОМ; Невский Диалект; 2000. – 368с.

8. Маянский А.Н. Лекции по иммунологии. – Нижний Новгород: изд-во НГМА, 2003. – 272 с.

9. Маянский А.Н. Фагоцитоз: проблемы и перспективы Нижегородский медицинский институт; Вестник РАМН – 1993, №4, с.52-55.

10. Маянский А.Н., Пикуза О.И. Клинические аспекты фагоцитоза. – Казань, 1993.

11. Новиков К.Н. Роль активных форм кислорода в биологических системах при воздействии факторов окружающей среды. // Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук. – 2004.

12. Пикуза О.И., Маянский А.Н. Клинические перспективы изучения фагоцитоза. – Казанский медицинский журнал, 1993, - №3 с.193-196.

13. Пинегин Б.В., Ярилин А.А., Симонова А.В., Климова С.В., Мазуров Д.В., Дамбаева С.В., Бахус Г.О. Пособие для врачей-лаборантов. М.: ГНЦ РФ – Институт Иммунологии Минздрава РФ, 2001.

14. Хаитов Р.М. Физиология иммунной системы. – М: Медицина, 2001. – 223 с.

15. Шиффман Фред Дж. Патофизиология крови: Пер. с англ. – М.; СПб., 2000.

16. Borg V. Zepelin M, Schuff-Werner P «Chemiluminescence of polymorphonuclear granulocytes in the presence of selected candida species». – 1994. – p.121-129

17. Lojek A., Kubala L., Cizova H., Ciz M. // Luminescence, 14: 1-4, 2002.

18. Miyagawa, B. & H.-G. Klingemann.. Phagocytosis and burst activity of granulocytes and monocytes after stem cell transplantation. J. Lab. Clin. Med. – 1997.

19. Pavelkova M., Kubala L. // Luminescence, 19: 37-42, 2004.