Анализ ДНК

Получение трансгенных мышей

 

 

Для первоначального анализа на трансгенность предложен ряд разнообразных методик. Обычно используют методом саузерн-блот, хотя дот-блот-гибридизация занимает меньше времени. Дополнительная информация, источником ко­торой служит первый из методов, в любом случае потребуется на более позднем этапе. ДНК хвоста следует обработать рестриктазой, высвобождающей внутренний фрагмент из интегриро­ванной конструкции ДНК, или ферментом, делающим в конст­рукции один разрез. Поскольку тандемное расположение превалирует, второй способ также даст фрагменты предсказуе­мого размера. Если бы трансген содержал последовательности, присутствующие также и в мышином геноме, можно было бы использовать зонд ДНК, гибридизующийся как с трансгеном, так и с собственным геном мыши при условии, что фрагменты, полученные в результате рестрикции, четко различаются. Это дает дополнительное преимущество при определении точного числа копий по силе гибридизационного сигнала.

 

4. Перенос генов с помощью ретровирусов

 

Как указывалось выше, ретровирусы используются для полу­чения трансгенных мышей путем воздействия инфекционным вирусом на предимплантационных эмбрионов. При этом частота трансформации зародышевой линии близка к той, кото­рую мы наблюдаем при микроинъекциях ДНК, а сама техника эксперимента намного проще. Ранние морулы освобождаются от блестящей оболочки, подвергаются кратковременному воз­действию инфекционным вирусом и трансплантируются псевдо­беременным приемным самкам. Различные способы ретровирусного генного переноса основаны на получении высокого титра клеточных линий, продуцирующих вирус.

Следует указать несколько важных пунктов, отличающих эти два пути трансгенеза:

• Трансгенные животные, полученные путем интеграции ретровирусов, всегда являются мозаиками с одним или более сайтов интеграции в различных клетках. Это обуслов­лено тем, что эмбрионы обычно инфицируются на стадии мору­лы, состоящей из 8—16 клеток. Вот почему для обнару­жения потомства, несущего вставочную последовательность, полученную с помощью ретровирусов, необходим скрининг.
• В то же время трансгенные животные, полученные путем инъек­ции ДНК в пронуклеусы, в большинстве случаев не мозаичны и соответственно передают новый ген 50% потомков. Ретровирусы обычно интегрируются в виде единственной копии генов в разные сайты генома хозяина и не вызывают перестроек ДНК в месте вставки, что часто наблюдается при инъекции ДНК. Следовательно, они позволяют более четко ин­терпретировать позиционные эффекты, обусловленные местом интеграции чужеродной ДНК и облегчают клонирование сайта инсерции (вставки), что особенно важно для молекуляр­ного анализа инсерционных мутаций. Поскольку сигналы контроля транскрипции самих вирусов в разнообразных тканях и особенно в клетках ранних эмбрионов слабы, для обеспечения как повсеместной, так и тканеспецифической экспрессии введен­ных генов использованы ретровирусные векторы, несущие соответствующие промоторы и энхансеры. Насколько широко может быть применен этот подход, еще предстоит оце­нить.

Во всяком случае, очевидно, что такие гены, как, например, ген мышечной дистрофии Дюшенна с размером мРНК 14 тысяч оснований, невозможно перенести с помо­щью ретровирусных векторов, но легко инъецировать в яйца. Следует также заметить, что конструирование ретровирусных векторов не столь тривиальная процедура, как получение плазмидных векторов для микроинъекции.

Важное преимущество использования ретровирусов заклю­чается в возможности их введения в эмбрионы более поздних стадий развития, чем предимплантационные, а также в специ­фические ткани взрослого животного. При инфекции клеток на разных этапах дифференцировки вирус может ока­заться уникальным маркером потомков отдельных клеток, позволяющим прослеживать судьбу клеточных линий. Этот подход очень перспективен при анализе сложных линей­ных отношений у эмбрионов млекопитающих и в тканях взрос­лых животных, например кроветворной ткани.

Возможность избирательного введения генов с помощью ретровирусов в кроветворную ткань взрослых организмов поз­воляет надеяться на реальность исправления дефектов, обуслов­ленных единичным геном, таких, например, как синдром комбинированного иммунодефицита. В настоящее время уже разработаны методики, обеспечивающие высокую эффектив­ность трансформации стволовых клеток гемопоэза, однако прежде, чем приступить к обсуждению практических вопросов применения в клинике, необходимо решить ряд проблем, касаю­щихся стабильности экспрессии и безопасности.

Культивируемые эмбриональные стволовые клет­ки инфицируют ретровирусными векторами, поддерживают в культуре, а затем вводят мыши путем инъекции в бластоцисту. Применение ретровирусной технологии может быть также использовано для трансформации клеток зародышевого пути других видов млекопитающих, у которых получение трансген­ных животных невозможно из-за отсутствия разработанных сис­тем культивирования эмбрионов или из-за затруднений с микро­инъекцией в зиготу.