Неудачи экспериментов с мышами.

Успешные опыты с амфибиями заставили ученых задуматься о клонировании эмбрионов млекопитающих, в частности мышей. Мак Киннел в одной из своих работ отмечал, что все необходимые для этого методы уже существуют, и непонятно, почему мышь до сих пор не клонирована. По его мнению, первыми объектами должны были стать именно мелкие животные, такие как мышь или кролик. Однако предсказание Мак Киннелла не сбылось, хотя в конце 70-х годов опыты на мышах действительно начались и протекали весьма драматично. К тому времени, замечу, весьма основательно были изучены биология и генетика ранних этапов развития млекопитающих, и, в частности, мыши как модельного объекта.

Работа методически оказалась довольно трудной, прежде всего потому, что объем яйцеклетки у млекопитающих примерно в тысячу раз меньше, чем у амфибий. Однако эти трудности были успешно преодолены. Экспериментаторы научились микрохирургическим путём удалять пронуклеусы [6] из зигот (оплодотворенных яйцеклеток) мыши и пересаживать в них клеточные ядра ранних эмбрионов. Однако все полученные разными способами зародыши мышей развивались лишь до стадии бластоцисты [7].

6. Пронуклеус - одно из двух гаплоидных ядер в яйце млекопитающих в период после проникновения сперматозоида, но до слияния мужского и женского пронуклеусов в ядро зиготы в процессе оплодотворения. Мужское ядро формируется из ядерного материала сперматозоида, женское - из хромосом яйцеклетки.

7. Бластоциста (бластула) - зародыш млекопитающих на одной из ранних стадий развития, еще до его имплантации в матку.

В 1977 году появилось сенсационное сообщение Хоппе и Илменси о том, что они получили семь взрослых самок мышей, пять из которых имели только материнский, а две - отцовский геном [8]. Это, якобы, зависело от тото, какой пронуклеус был оставлен в яйце - женский или мужской, он и определял развитие особи но типу гиногенеза или андрогенеза. Их успех был связан, но описанию авторов, с тем, что, удаляя один пронуклеус, они удваивали число хромосом другого, обрабатывая яйца специальным веществом, затем выращивали полученные диплоидные гомозиготные (с двумя одинаковыми наборами генов) зародыши in vitro до стадии бластоцисты и пересаживали в матку самки-реципиента для дальнейшего развития.

Казалось, теперь можно будет быстро получать млекопитающих со 100%-ной гомозиготностью по всем генам. Это особенно важно в селекции, так как для получения сельскохозяйственных животных, в частности, крупного рогатого скота, с закрепленными особо ценными качествами обычными приемами требуются десятки лет работы.

Однако, к сожалению, данные Хоппе и Илменси подтвердить не удалось, хотя многие пытались это сделать. Оказалось, что полученные любым способом диплоидные андрогенетические и гиногенетические зародыши мышей погибают на тех же стадиях, что и диплоидные партеногенетические (развивающиеся из неоплодотворенной яйцеклетки) эмбрионы.

Значительно усовершенствовав методы извлечения ядер и введения их в клетку. МакГрат и Солтер провели свою серию экспериментов и сообщили, что высокий выход живых мышей они получили, когда в качестве доноров ядер использовали зиготы. Но если донорами были ранние эмбрионы, то реконструированные яйцеклетки, как и прежде, развивались только до стадии бластоцисты.

Метод МакГрата и Солтера стал широко использоваться разными экспериментаторами. Так, Манн и Ловел-Бадж выделяли пронуклеусы из яиц, активированных к партеногенезу, и пересаживали их энуклеированные зиготы мышей. В этих случаях эмбрионы погибали на ранних стадиях. Если же наоборот, пронуклеусы получали из оплодотворенных яиц и пересаживали в партеногенетически активированные и лишенные ядра яйца, то такие зародыши развивались нормально до рождения. Сурани с соавторами установили, что если добавить женский пронуклеус из зиготы мыши к гаплоидному набору хромосом яйцеклетки, то нормального развития не происходит, добавление же мужского ядра приводит к нормальному развитию. С другой стороны, рекомбинации мужского и женского пронуклеусов из разных оплодотворенных яйцеклеток мышей обеспечивает нормальное развитие, а комбинация двух мужских или двух женских пронуклеусов останавливает развитие эмбриона.

Эти опыты показали, что для нормального развития млекопитающих требуются два набора хромосом - отцовский и материнский. Поэтому ни у одного из известных видов млекопитающих не описан партеногенез. Поэтому работы Хоппе и Илменси не удалось повторить.

Однако эти исследователи еще дважды будоражили научное сообщество. В 1982 году они пересадили ядра клеток партеногенетических бластоцист мышей в энуклеированные зиготы. Некоторые из этих реконструированных яйцеклеток нормально развивались, и якобы были получены четыре взрослых самки. В свете вышесказанного эти результаты весьма маловероятны.

Гибель партеногенетических (гиногенетических) и андрогенетических зародышей у млекопитающих связана с различной активностью в онтогенезе материнского и отцовского геномов. Механизм, регулирующий эти функциональные различия, был назван геномным импринтингом и изучался в ряде работ, где было показано, что для нормального развития млекопитающих требуется наличие мужского генома. Другая статья Илменси и Хоппе имела еще больший резонанс.

Авторы сообщили о пересадке ядер клеток внутренней клеточной массы бластоцисты в энуклеированные зиготы мышей и получении трех взрослых мышей (двух самок и самца), генетически идентичных донорской линии мышей. Введение ядер-доноров и удаление пронуклеусов из зиготы проводили за один прием, затем реконструированные яйцеклетки культивировали in vitro до стадии бластоцисты и пересаживали в матку самок. Из 16-ти пересаженных бластоцист три развились во взрослых животных. В следующей работе (1982) эти же авторы использовали в качестве доноров ядер клетки эмбрионов еще более поздних стадий (7 суток) и будто бы получили трех половозрелых мышей. Однако никто из работающих в том же направлении не смог добиться подобных результатов, и достоверность данных Илменси и Хоппе была вновь поставлена под сомнение.

МакГрат и Солтер показали, что ядра 8-клеточных зародышей и клеток внутренней клеточной массы бластоцисты не обеспечивают развитие in vitro реконструированных яйцеклеток даже до стадии морулы, которая предшествует стадии бластоцисты. Небольшая часть (5%) ядер 4-клеточных зародышей дает возможность развиваться только до стадии морулы. В то же время 19% реконструированных яйцеклеток, содержащих ядра 2-клеточных зародышей, смогли достичь стадии морулы или бластоцисты.

Эти и многие другие данные показывают, что в эмбриогенезе у мышей клеточные ядра рано теряют тотипотентность, что связано, очевидно, с очень ранней активацией генома зародыша - уже на стадии 2-х клеток. У других млекопитающих, в частности, у кроликов, овец и крупного рогатого скота, активация первой группы генов в эмбриогенезе происходит позднее, на 8-16-клеточной стадии. Возможно, поэтому первые значительные успехи в клонировании эмбрионов были достигнуты на других видах млекопитающих, а не на мышах. Тем не менее, работы с мышами, несмотря на их непростую судьбу, значительно расширили наши представления о методологии клонирования млекопитающих.