Антимикробная ФДТ

 

Актуальность развития этого направления ФДТ связана с проблемами при проведении традиционной терапии инфекционных заболеваний: распространением патогенных штаммов микроорганизмов с множественной устойчивостью к антибиотикам, побочными эффектами при проведении системного лечения антимикробными препаратами. Преимущество метода ФДТ при лечении микробных поражений определяется возможностью избирательного накопления фотосенсибилизатора клетками патогенов и локальностью светового воздействия (в том числе за счет применения световолоконной оптики и эндоскопической техники). Кроме того, неспецифичность фотодинамического действия практически исключает развитие микробной устойчивости к ФДТ.

В настоящее время показана возможность применения ФДТ для лечения микозов, раневых инфекций, трофических язв, язвенной болезни желудка (в патогенезе которой основная роль принадлежит грамм-отрицательной бактерии Helicobacter pylori) и других инфекционных заболеваний.

Основные мишени фотодинамической инактивации бактериальных клеток - ДНК и цитоплазматическая мембрана. Предполагается, что фотоокислительная деструкция ДНК (преимущественно за счет окисления гуанозина), имеющая место при действии многих фотосенсибилизаторов, не является главной причиной гибели бактериальной клетки, тогда как цитоплазматическая мембрана может быть критической клеточной мишенью: ее необратимое повреждение приводит к вытеканию внутриклеточного содержимого, инактивации ферментов и транспортных систем, а также нарушению синтеза клеточной стенки.

Ключевую роль в возможности фотодинамической инактивации микроорганизма играет способность фотосенсибилизатора связаться с поверхностью клетки. Так, фотодинамическую активность катионных красителей и отсутствие таковой анионных в отношении грамм-отрицательных бактерий связывают с более эффективным взаимодействием катионных фотосенсибилизаторов с отрицательно заряженной поверхностью бактерий (Рис. 2).

 

Рис. 2. Строение клеточной стенки грамм-отрицательной бактерии (толщина – 10-15 нм) (по Hamblin and Hasan, 2004).

 

Отрицательный заряд поверхности клеток большинства штаммов грам-отрицательных бактерий обусловлен отрицательно-заряженными группами компонентов клеточных стенок – липополисахаридов (ЛПС). Дзета-потенциал (потенциал границы скольжения клетки (частицы) относительно потенциала объема раствора) составляет (-20) – (-40) мВ для грам-отрицательных бактерий и около (-10) мВ для дрожжевых грибов (Рис. 3).

.

 

 

 

Рис. 3. Строение клеточной стенки дрожжевой клетки (толщина 100-250 нм).

 

Практическая часть

 

Цель работы:

 

Исследовать сравнительную эффективность действия различных фотосенсибилизаторов на клетки дрожжей и грамм-отрицательных бактерий.

 

Задачи:

1. Исследовать сравнительную эффективность инактивации клеток дрожжей фотосенсибилизаторами разных типов;

2. Исследовать сравнительную эффективность инактивации грамм-отрицательных бактерий фотосенсибилизаторами разных типов;

3. Исследовать влияние одновалентных и двухвалентных солей на эффективность фотодинамического действия положительно заряженного фотосенсибилизатора.

 

 

 

 

Рис. 4. Бактериальная биолюминесцентная тест-система на основе Escherichia coli pXen7 ( лиофилизированный генно-инженерный штамм E.coli pXen7, полученный путем клонирования lux-AB генов термостабильной люциферазы почвенной бактерии Photorhabdus luminiscence zm1 в Escherichia coli K12). (По: L.Y-C. Lin and E.A. Meighen. 2004 )

 

Материалы и методы:

 

Объекты исследовании. Биосенсор " Эколюм" - лиофилизированный генно-инженерный штамм E.coli pXen7 (рис. 4);

штамм дрожжей Candida guilliermondii ВСБ-656 (культура получена во ВНИИсинтезбелок, Москва).

 

 

Фотосенсибилизаторы:

октакис-(холинил)замещенный фталоцианин цинка (ZnPcChol⁸⁺) – Холосенс; анионные тетракис-(сульфо)замещенный фталоцианин алюминия (AlPc^4-) - Фотосенс; метиленовый синий; профлавин ацетат; бенгальский розовый (красители синтезированы в ФГУП ГНЦ «НИОПИК»).

 

Соли: 1% растворы KNO₃, KCl, MgSO₄, CaCl₂

Люминометр “Биотокс-6” (Москва) с набором кювет объемом 1, 5 мл для измерения интенсивности биолюминесценции биосенсора " Эколюм". Принцип действия прибора основан на регистрации слабых световых потоков с помощью фотоэлектронного умножителя (ФЭУ), работающего в режиме счета анодных импульсов. Область максимальной спектральной чувствительности ФЭУ располагается в диапазоне 380-490 нм.

Ход работы:

 

Для проведения исследования по сравнению эффективности действия различных фотосенсибилизаторов на бактерии и клетки дрожжей необходимо добавить в соответствующие пробы:

№ 1, 2 - 0, 5 и 1 мкМ Холосенса;

№ 3, 4 - 1 и 5 мкМ Фотосенса;

№ 5, 6 - 0, 5 и 1 мкМ метиленового синего;

№ 7, 8 - 0, 5 и 1 мкМ профлавина ацетата;

№ 9, 10 - 5 мкМ и 10 мкМ бенгальского розового.

Облучение проб №1-10 проводить ртутной лампой с фильтром БС-8.

 

Для проведения исследования влияния солей на эффективность фотодинамического действия положительно заряженного фотосенсибилизатора на бактерии и клетки дрожжей в каждую пробу необходимо добавить 0, 5 мкМ Холосенса и следующие соли:

№ 1 – без соли;

№ 2, 3 - 0, 1 и 0, 5% KNO_3;

№ 4, 5 - 0, 1 и 0, 5% KCl;

№ 6, 7 - 0, 01 и 0, 1% MgSO₄;

№ 8, 9 - 0, 01 и 0, 1% CaCl₂;

Облучение проб № 1-10 проводить фотодиодом (684 нм).

1. Исследование сравнительной эффективности действия различных фотосенсибилизаторов на бактерии методом биолюминесценции.

 

Методика основана на определении изменения интенсивности биолюминесценции генно-инженерного штамма бактерий при воздействии токсических веществ, присутствующих в анализируемой пробе, по сравнению с контролем.

Хемилюминесцентная реакция, непосредственно сопровождаемая свечением, катализируется ферментом — бактериальной люциферазой и включает в себя процессы окисления восстановленного флавинмононуклеотида ФМН-Н2 до ФМН и одновременно - алифатического (С14) альдегида до миристиновой (С14) кислоты. Эта реакция протекает, по-видимому, через стадию образования пероксида флавинмононуклеотида:

 

ФМН-H₂ + E + O2 ® E-ФМН-H₂-OOH

RCHO-E-ФМН-H₂-OOH ® RCOOH + E-ФМН-HOH* ®

® RCOOH + E + ФМН + H₂O + фотон (490 нм)

 

Здесь E - люцифераза, OOH - гидроперекисная группа, RCOH - алифатический альдегид, RCOOH - жирная кислота, образующаяся при окислении альдегида.

 

Подготовка тест-объекта " Эколюм":

Регидратировать лиофилизированные бактерии в 20 мл дистиллированной воды. Колбу с полученной суспензией бактерий несколько раз встряхнуть. Довести температуру суспензии бактерий до комнатной температуры (15-25°С) и выдержать суспензию в этих условиях 1, 5-2 часа. Рекомендуется перемешивание рабочей суспензии бактерий перед отбором проб для исследования.

Определение рабочей концентрации биосенсора " Эколюм":

Измерить фоновое значение сигнала прибора " Биотокс" за 10 сек без кюветы. Добавить 1 мл суспензии бактерий из колбы в кювету люминометра. Снять крышку кюветного отделения, повернув ее против часовой стрелки до упора. Установить пробирку с образцом биосенсора в кюветное отделение. Закрыть кюветное отделение крышкой, повернув ее по часовой стрелке до упора. Прибор при этом приводится в рабочее состояние (открывается оптический канал между биосенсором и ФЭУ). Измерить величину интенсивности биолюминесценции за 10 сек.

Свечение рабочей суспензии бактерий должно находиться в интервале, превышающим фоновое значение прибора в 25-250 раз. Если обнаруженная величина меньше интервала, следует увеличить добавку биосенсора и повторить измерение. Если величина больше интервала, следует разбавить суспензию бактерий дистиллированной водой и повторить измерение.

Определение токсичности фотосенсибилизаторов в анализируемых пробах.

Подготовить к работе исследуемые (подвергаемые облучению в присутствии фотосенсибилизатора) пробы: добавить в пробу (1 мл суспензии бактерий) фотосенсибилизатор, а также соль (в экспериментах по исследованию влияния солей на эффективность фотодинамического действия фотосенсибилизатора) в необходимых концентрациях и провести инкубацию с добавками в течение 10 мин. Измерить интенсивность биолюминесценции после инкубации. Облучить пробу в течение 30 сек фотодиодом (или 60 сек ртутной лампой) после чего измерить интенсивность ее свечения. Повторять облучение пробы по 30 (или 60) сек, пока уровень свечения не составит ~10% от исходного значения.

Рассчитать значение темновой токсичности фотосенсибилизатора по формуле:

Т_т=100(I_о-I_т)/ I_о,

где I_о и I_т – интенсивность свечения пробы до и после инкубации с добавками соответственно.

Критерием фототоксического действия является изменение интенсивности биолюминесценции биосенсора в пробе после облучения по сравнению с интенсивностью биолюминесценции той же пробы, препроинкубированной с фотосенсибилизатором, до облучения. Уменьшение интенсивности биолюминесценции пропорционально фототоксическому эффекту, количественная оценка которого выражается в виде безразмерной величины - индекса фототоксичности " Т", определяемого следующим образом:

Т_ф=100(I_т-I_ф)/ I_т,

где I_т и I_ф - интенсивность свечения пробы до и после облучения соответственно.

2. Исследование эффективности действия фотосенсибилизаторов на клетки дрожжей по их выживаемости:

В экспериментах используются дрожжи, выращенные при 32^оС на качалке (160 об/мин) в течение 5 часов (жидкая питательная среда – NH₄H₂PO₄ -2%, (NH₄)₂HPO₄ – 0, 5%, K₂SO₄ – 0, 2%, MgSO₄ – 0, 2%, дрожжевой автолизат - 0, 5%, сахароза – 1%), из клеток, смытых с суточного косяка (сусло-агар). Облучение суспензий дрожжей (~10⁶) проводится в минеральной среде вышеописанного состава с 1% сахарозы в стеклянных пробирках при комнатной температуре.

Подготовить к работе исследуемые (подвергаемые облучению в присутствии фотосенсибилизатора) пробы: добавить в пробу (1 мл суспензии клеток дрожжей) фотосенсибилизатор, а также соль (в экспериментах по исследованию влияния солей на эффективность фотодинамического действия фотосенсибилизатора) в необходимых концентрациях и провести инкубацию с добавками в течение 10 мин. Отобрать из пробы 50 мкл суспензии и провести посев на твердую среду (сусло-агар) в чашке Петри. Далее облучить пробу в течение 10 сек фотодиодом (или 60 сек ртутной лампой) 2-3 раза, после каждого периода облучения производя посев культуры. Подсчет выживаемости дрожжей произвести через сутки роста культуры при 32^оС методом микроколоний под микроскопом.

Рассчитать фототоксичность:

Т_ф = S_т - S_ф

где S_т и S_ф - выживаемость дрожжей до и после облучения соответственно.

Обработка результатов:

По результатам исследования фотодинамического действия различных фотосенсибилизаторов на клетки бактерий и дрожжей:

построить графики зависимости интенсивности биолюминесценции бактерий и выживаемости дрожжей (1- Т_ф) от дозы света D. Доза света определяется по формуле D(Дж/см²) = I(Вт/см²)*t(сек), где D – доза света, I - интенсивность света, t - время облучения. Определить параметр D₅₀ - дозу света, при которой достигается 50%-ое снижение интенсивности биолюминесценции бактерий или выживаемости дрожжей. Высчитать фоточувствительность ФЧ₅₀ как величину обратную D₅₀. Сравнить значения фоточувствительности для разных фотосенсибилизаторов.

По результатам исследования влияния солей на эффективность фотодинамического действия Холосенса:

построить графики зависимости интенсивности биолюминесценции бактерий и выживаемости дрожжей (1-Т_ф) от дозы света D. Для фиксированной дозы света определить параметр К:

К = (1-Т_ф)_соль/(1-Т_ф), где

(1-Т_ф)_соль - интенсивность биолюминесценции бактерий или выживаемость дрожжей для пробы, содержащей Холосенс и соль,

(1-Т_ф) - интенсивность биолюминесценции бактерий или выживаемость дрожжей для пробы, содержащей только Холосенс.

Вопросы для обсуждения:

1. Чем могут быть вызваны различия в эффективности фотодинамического действия разных фотосенсибилизаторов на определенную культуру клеток?

2. Чем могут быть вызваны различия в эффективности фотодинамического действия определенного фотосенсибилизатора на бактерии и дрожжи?

3. Какова взаимосвязь спектральных характеристик фотосенсибилизатора и источника излучения с фотодинамическим эффектом?

4. Какова зависимость фотодинамического эффекта от концентрации фотосенсибилизатора? С чем может быть связана нелинейность этой зависимости?

5. Как присутствие солей в среде влияет на эффективность фотодинамического действия? С чем могут быть связаны наблюдаемые эффекты?

6. Каковы различия эффектов одновалентных и двухвалентных солей? С чем могут быть связаны эти различия?

Литература:

· Макаров Д. А., Кузнецова Н. А., Южакова О. А., Савина Л. П., Калия О. Л., Лукьянец Е. А., Негримовский В. М., Страховская М. Г. Поликатионные фталоцианины цинка и алюминия: синтез, влияние степени замещения на физико-химические свойства и фотодинамическую активность в водной среде. Журнал физической химии. 2009. 83(6): 1183-1190.

· Миронов А.Ф. Фотодинамическая терапия рака - новый эффективный метод диагностики и лечения злокачественных опухолей. Соросовский образовательный журнал, 1996(8): 32-40.

· Рубин А.Б., Фрайкин Г.Я. Первичные молекулярные механизмы фотобиологических процессов и деструктивное действие оптического излучения. Успехи современной биологии. 1987. 103(3): 323-339.

· Страховская М. Г., Антоненко Ю. Н., Пашковская А. А., Котова Е. А., Киреев В., Жуховицкий В. Г., Кузнецова Н. А., Южакова О. А., Негримовский В. М., Рубин А. Б. Электростатическое связывание замещенных металлофталоцианинов с клетками энтеробактерий: роль в фотодинамической инактивации. Биохимия. 2009. 74 (12): 1603-1614.

· Alves E., Costa L., Carvalho C.M., Tomé J.P., Faustino M.A., Neves M.G., Tomé A.C., Cavaleiro J.A., Cunha A., Almeida A. Charge effect on the photoinactivation of Gram-negative and Gram-positive bacteria by cationic meso-substituted porphyrins. BMC Microbiol. 2009 15; 9: 70.

· Dougherty T.J., Gomer C.J., Henderson B.W., Jori G., Kessel D., Korbelik M., Moan J., Peng Q. Photodynamic therapy. J. Natl. Cancer Inst. 1998 17; 90(12): 889-905. Review.

· Hamblin M.R., Hasan T. Photodynamic therapy: a new antimicrobial approach to infectious disease? Photochem. Photobiol. Sci. 2004. 3(5): 436-50.

· Jori G., Fabris C., Soncin M., Ferro S., Coppellotti O., Dei D., Fantetti L., Chiti G., Roncucci G. Photodynamic therapy in the treatment of microbial infections: basic principles and perspective applications. Lasers Surg. Med. 2006; 38(5): 468-81.

· Maisch T., Szeimies R.M., Jori G., Abels C. Antibacterial photodynamic therapy in dermatology. Photochem. Photobiol. Sci. 2004; 3(10): 907-17.

· Wainwright M. Photodynamic antimicrobial chemotherapy (PACT). J. Antimicrob. Chemother. 1998. 42(1): 13-28. Review.