Инфекционный процесс

Инфекционный процесс в восприимчивом организме человека возникает после воздействия на него различными факторами патогенности микроорганизмов. Это могут быть разнообразные ферменты, токсины, белки, поверхностные вещества, капсула и пр. Организм защищается и противодействует факторам патогенности и самому микроорганизму своими многочисленными факторами иммунного ответа и общего действия: например, Т-лимфоциты, В-лимфоциты, антитела, фагоциты, система комплемента, медиаторы, секреты слизистых, интерферон и пр.

Рассмотрим некоторые из факторов защиты организма человека.

Фагоцитоз - важный клеточный фактор общей резистентности организма. Поскольку фагоцит должен осуществлять ряд функций для проявления своей фагоцитарной активности, существуют разные методы определения фагоцитарной активности и наличия хемотаксиса.

Наработано несколько способов определения активности фагоцитов:

1. Выделенные нейтрофилы соединяют на предметном стекле с половинным по объему количеству грибов Candida albicans. Затем фагоциты разрушают дезоксихолатом натрия (2, 5 % раствор) и вносят 0, 01 % раствор метиленовой синей для окраски грибов, потерявших жизнеспособность. Подсчитывают число убитых грибов.

2. Кровь из пальца в количестве 0, 1 мл помещают на стерильное покровное стекло и выдерживают во влажной камере 45 мин при 45⁰ С, после чего сгусток удаляют пинцетом. Покровное стекло с прикрепленными к нему нейтрофилами промывают в растворе Хенкса, вносят к ним расчетную дозу грибов и стекло помещают во влажную камеру, клетками вверх на 30 мин при 45⁰ С. Затем стекло промывают в растворе Хенкса и высушивают. Препарат окрашивают по методу Романовского-Гимзе, подсчитывают фагоцитарное число - процент фагоцитов, поглотивших грибы, фагоцитарный индекс - среднее число поглощенных частиц на 1 фагоцит.

3. Определение кислородного метаболизма фагоцитов (НСТ-тест). Каплю крови из пальца помещают на предметное стекло, инкубируют во влажной камере 60 мин при 37⁰ С. Снимают эритроцитарный слой иглой, обводя по периметру и подцепив его. Предметное стекло заливают нитросиним тетразолием, инкубируют 20 мин при 37⁰ С и подсушивают. Фиксируют метанолом и красят 2 % раствором метиленовым зеленым 12-15 мин. Считают клетки с гранулами формазана. В активных фагоцитах бесцветный НСТ превращается в синий нерастворимый формазан.

Активность системы комплемента. Система комплемента играет важную роль в реализации воспалительных и иммунных реакций. Название комплемент – дано литической системе П.Эрлихом (1900).

Метод определения активности комплемента заключается в определении 50 % гемолиза - наибольшем разведении комплемента, обеспечивающем гемолиз 50 % взвеси эритроцитов.

Вначале создается гемолитическая система: смешивают равные объемы - 5 % взвеси нативных эритроцитов барана и гемолитической сыворотки в трехкратной концентрации (в концентрация, в три раза выше, чем титр). Выдерживают 30 мин при 37⁰ С и отмывают от свободных антител и других элементов сыворотки. Гемсистему (осадок эритроцитов барана, нагруженных антителами гемолитической сыворотки) ресуспендируют до 5 % взвеси.

Исследуемую сыворотку в разведении 1: 10 разливают: в первую пробирку в объеме 0, 05 мл, во вторую - 0, 1 мл, в третью - 0, 15 мл, в четвертую - 0, 20 мл, в пятую - 0, 25 мл, в шестую - 0, 30 мл, в седьмую - 0, 35 мл, в восьмую - 0, 40 мл, в девятую - 0, 45 мл, в десятую - 0, 50 мл.

Вносят в пробирки 0, 85 % раствор хлорида натрия до 1, 5 мл в каждую пробирку, т.е. в первую -1, 45 мл, во вторую - 1, 4 мл и т.д. Затем в каждую из этих пробирок вносят по 1, 5 мл гемолитической системы и инкубируют 45 мин при 37⁰ С. Степень гемолиза измеряют на ФЭК или делают предварительно 10 пробирок с разной степенью гемолиза равной взвеси эритроцитов: первая пробирка - 100 % гемолиз, вторая - 90 %, третья - 80 % и т.д. до 10 % гемолиза. Сравнивая пробирки, определяют 50 % гемолиз в опытном ряду.

Лизоцим Один из факторов общей резистентности организма. Фермент, оказывающий бактерицидное действие на кокковую микрофлору. Определение активности этого фермента проводят следующим образом. В 5 пробирок вносят 0, 9 мл 0, 85 % раствора хлорида натрия, а затем в первую пробирку вносят 0, 1 мл лизоцима в разведении 1: 10, перемешивают, после чего готовят 10-кратные разведения, путем переноса 0, 1 мл раствора лизоцима из первой пробирки во вторую, после перемешивания, переносят 0, 1 мл в третью и т.д. до разведения 1: 10000 (четвертая пробирка). Пятая пробирка - контроль (не содержит лизоцима). Во все пробирки вносят по 0, 5 мл 1 млрд взвеси Micrococcus lisodeiecus или другой микроб. Смесь перемешивают и инкубируют в термостате при 37⁰ С в течение 3 ч. Отмечают наибольшее разведение лизоцима, вызвавшее лизис микробов.

Метод Манчини (определение сывороточных иммуноглобулинов). На ровной плоской поверхности (стеклянная пластина, крышка от пластины для иммунологических реакций) создают слой геля, толщиной 1-2 мм, содержащий антисыворотку к определенному классу ИГ человека.

В геле штампуют лунки, которые затем заполняют испытуемыми сыворотками человека для определения количества иммуноглобулинов.

Пластины оставляют на 2-5 дней и учитывают результат. Молекулы иммуноглобулинов диффундируют в геле во все стороны и в месте оптимальной концентрации образуют кольцо преципитации - как результат реакции с антисывороткой. Диаметр кольца преципитации должен соответствовать количественному содержанию ИГ в исследуемой сыворотке.

Специальной линейкой измеряют наибольший диаметр кольца преципитации, а затем по таблицам определяют количество ИГ в исследуемой сыворотке. В норме содержание ИГ в сыворотке колеблется в пределах: IgM - 0, 65-1, 65 г/л, IgG - 7, 50-15, 45 г/л, IgA - 1, 25-2, 50 г/л.

РТМЛ – реакция торможения миграции лейкоцитов. РТМЛ основана на феномене подавления миграции лейкоцитов фактором, который выделяют сенсибилизированные лейкоциты при взаимодействии с чужеродным агентом.

Силиконизированные капилляры заполняют взвесью лейкоцитов крови, вводят в них клетки «чужака», центрифугируют в течение 5 мин при 1000 об. в мин, затем отламывают конец капилляра, не содержащего осадка клеток. Бактерии, вирусы и пр. агенты добавляют или в суспензию лейкоцитов или в инкубационную камеру. Капилляры помещают в камеру с питательной средой 199 и инкубируют при 37^о С в течение 18-24 ч. Лейкоциты мигрируют из капилляра и образуют зону помутнения в среде. Площадь зоны помутнения проецируют на бумагу. Вычисляют индекс подавления миграции лейкоцитов агентом в сравнении с контрольной миграцией лейкоцитов без агента.

РБТЛ –реакция бласттрансформации лимфоцитов. Реакция основана на феномене активации лимфоцитов под влиянием стимула (митогена), с трансформацией их в бласты – большие делящиеся клетки. Этим определяется пролиферативная потенция лимфоцитов.

Свежую гепаринизированную кровь человека в количестве 0, 6 мл разводят в 5 раз средой Игла с добавлением 20 мл (в концентрации 80 мкг/мл) глутамина и вносят по 100 мкл вместе с митогеном в 96-луночные планшеты для иммунологических реакций. В качестве мутагена можно использовать лаконос (PWM) в концентрации 5 мг/мл. Планшеты оставляют совместно с СО₂ при 37⁰ С на 72 ч, но за 16 ч до окончания инкубации вносят 5 мкг Ки/мл ³Н-тимидин. После завершения культивирования, клетки снимают с помощью харвестра на нитроцеллюлозные фильтры.

Уровень бласттрансформации лимфоцитов оценивают по интенсивности включения тимидина с помощью счетчика и жидкостного сцинцилятора и выражают в импульсах в мин. Индекс стимуляции рассчитывают из соотношений показателей митогениндуцированной и спонтанной бласттрансформации лимфоцитов.

Цитотоксический тест лимфоцитов. Лимфоциты периферической крови способны разрушать in vitro клетки-мишени как сенсибилизированные, та и не сенсибилизированные антителами. Это свойство лимфоцитов используют для оценки киллерной активности.

1. Оценка активности К-клеток. В качестве клеток-мишеней в данном тесте применяют эритроциты барана. К 0, 1 мл 0, 5 % взвеси нативных эритроцитов барана добавляют 0, 01 мл суспензии лимфоцитов и инкубируют 3-4 ч при 37^о С. Далее смесь центрифугируют при 500 об. в мин в течение 10 мин. Супернатант удаляют. Цитотоксическую активность определяют по выходу гемоглобина из лизированных клеток. К супернатанту добавляют 0, 2 мл бензидина и 0, 2 мл 3 % Н₂О₂. Далее на спектрофотометре определяют оптическую плотность жидкости.

2. Оценка активности естественных киллеров (NK-клеток). В качестве клеток-мишеней берут опухолевые клетки. В ячейки круглодонной пластины помещают 1-2 ^. 10⁴ меченых клеток-мишеней, к ним добавляют лимфоциты – 1-1, 5 ^. 106 клеток в мл. Смесь инкубируют при 370 С в течение 4-14 ч. Активность естественных киллеров определяют по выделению в надосадок радиоактивного изотопа.

3. Цитотоксический тест. Можно установить факт присоединения антител к клеткам с помощью определения жизнеспособности клеток в цитотоксическом тесте.

В лунки панели типа Такачи для микротитрования вносят суспензию клеток, сыворотку к ним и комплемент. Инкубируют смесь при 37^о С в течение 40 мин. Затем проводят окраску клеток трепановым синим, фиксируют их формальдегидом, переносят каплю смеси на предметное стекло и с использованием светового микроскопа определяют количество клеток, потерявших жизнеспособность, т.е. окрашенных. По сути – это реакция прямого гемолиза.

Определение ЦИК (циркулирующих иммунных комплексов). Сыворотку крови разводят 0, 85 % раствором хлорида натрия 1: 25, смешивают с 7 % взвесью ПЭГ (полиэтиленгликоля) 1: 1. Пробирки помещают в холодильник на 18 ч, затем центрифугируют 15 мин при 1500 об в мин, удаляют супернатант, а осадок растворяют в 2, 5 мл 0, 1 н раствора NaOH, тщательно его перемешивают, оставляют при комнатной температуре на 30 мин. Пробы замеряют на спектрофотографе с длиной волн 280 нм против 0, 1 раствора NaOH. Уровни ЦИК выражают в ЕОП (единице оптической плотности). Уровни ЦИК в норме не должны превышать 0, 110 ЕОП.

Второй способ. На культуре клеток линии Raji находятся рецепторы к С3 компоненту комплемента. При добавлении исследуемой пробы к этим клеткам иммунный комплексы, связанные с С3 компонентом будут фиксированы на клетках. Они выявляются с помощью меченых ферментом кроличьих антител к иммуноглобулинам сыворотки человека (по типу ИФА).

Определение поверхностных СD-антигенов

Реакция широко применяется, например, при обследовании ВИЧ-инфицированных, в диагностике иммунодефицита и пр. Разработаны разные модификации определения CD- антигенов. В основе метода лежит определение специфических маркеров лимфоцитов и других клеток, с помощью моноклональных антител. Например, Т-лимфоциты содержат СD3+, Т-хелпер (Т-индуктор) СD4+, Т-киллер и Т-супрессор СD8+, В-лимфоциты СD19+ и т.д.

Применяют моноклональные антитела, получаемые при слиянии миеломных клеток с плазматическими клетками, к одному из маркеров клеток. Полученные моноклональные антитела к одному из СD-антигенов, метят флюооресцеином, например, изотиоционатом, антитела к другому СD-антигену метят фикоэритритом. Смешивают такие моноклональные антитела с лимфоцитами и мазок помещают в люминисцентный микроскоп. Под действием света с длиной волны 488 нм первый краситель излучает зеленый цвет, а второй – оранжевый цвет. Возможно применение нового флюорохрома перидинина, излучающего красный цвет. Используя три флюорохрома возможно одновременное определение трех разных СD-антигенов в люминисцентном микроскопе.