Студопедия Главная Случайная страница Обратная связь

Разделы: Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

Инфекционный процесс




Инфекционный процесс в восприимчивом организме человека возникает после воздействия на него различными факторами патогенности микроорганизмов. Это могут быть разнообразные ферменты, токсины, белки, поверхностные вещества, капсула и пр. Организм защищается и противодействует факторам патогенности и самому микроорганизму своими многочисленными факторами иммунного ответа и общего действия: например, Т-лимфоциты, В-лимфоциты, антитела, фагоциты, система комплемента, медиаторы, секреты слизистых, интерферон и пр.

Рассмотрим некоторые из факторов защиты организма человека.

Фагоцитоз - важный клеточный фактор общей резистентности организма. Поскольку фагоцит должен осуществлять ряд функций для проявления своей фагоцитарной активности, существуют разные методы определения фагоцитарной активности и наличия хемотаксиса.

Наработано несколько способов определения активности фагоцитов:

1. Выделенные нейтрофилы соединяют на предметном стекле с половинным по объему количеству грибов Candida albicans. Затем фагоциты разрушают дезоксихолатом натрия (2,5 % раствор) и вносят 0,01 % раствор метиленовой синей для окраски грибов, потерявших жизнеспособность. Подсчитывают число убитых грибов.

2. Кровь из пальца в количестве 0,1 мл помещают на стерильное покровное стекло и выдерживают во влажной камере 45 мин при 450 С, после чего сгусток удаляют пинцетом. Покровное стекло с прикрепленными к нему нейтрофилами промывают в растворе Хенкса, вносят к ним расчетную дозу грибов и стекло помещают во влажную камеру, клетками вверх на 30 мин при 450 С. Затем стекло промывают в растворе Хенкса и высушивают. Препарат окрашивают по методу Романовского-Гимзе, подсчитывают фагоцитарное число - процент фагоцитов, поглотивших грибы, фагоцитарный индекс - среднее число поглощенных частиц на 1 фагоцит.

3. Определение кислородного метаболизма фагоцитов (НСТ-тест). Каплю крови из пальца помещают на предметное стекло, инкубируют во влажной камере 60 мин при 370 С. Снимают эритроцитарный слой иглой, обводя по периметру и подцепив его. Предметное стекло заливают нитросиним тетразолием, инкубируют 20 мин при 370 С и подсушивают. Фиксируют метанолом и красят 2 % раствором метиленовым зеленым 12-15 мин. Считают клетки с гранулами формазана. В активных фагоцитах бесцветный НСТ превращается в синий нерастворимый формазан.

Активность системы комплемента. Система комплемента играет важную роль в реализации воспалительных и иммунных реакций. Название комплемент – дано литической системе П.Эрлихом (1900).

Метод определения активности комплемента заключается в определении 50 % гемолиза - наибольшем разведении комплемента, обеспечивающем гемолиз 50 % взвеси эритроцитов.

Вначале создается гемолитическая система:смешивают равные объемы - 5 % взвеси нативных эритроцитов барана и гемолитической сыворотки в трехкратной концентрации (в концентрация, в три раза выше, чем титр). Выдерживают 30 мин при 370 С и отмывают от свободных антител и других элементов сыворотки. Гемсистему (осадок эритроцитов барана, нагруженных антителами гемолитической сыворотки) ресуспендируют до 5 % взвеси.

Исследуемую сыворотку в разведении 1:10 разливают: в первую пробирку в объеме 0,05 мл, во вторую - 0,1 мл, в третью - 0,15 мл, в четвертую - 0,20 мл, в пятую - 0,25 мл, в шестую - 0,30 мл, в седьмую - 0,35 мл, в восьмую - 0,40 мл, в девятую - 0,45 мл, в десятую - 0,50 мл.

Вносят в пробирки 0,85 % раствор хлорида натрия до 1,5 мл в каждую пробирку, т.е. в первую -1,45 мл, во вторую - 1,4 мл и т.д. Затем в каждую из этих пробирок вносят по 1,5 мл гемолитической системы и инкубируют 45 мин при 370 С. Степень гемолиза измеряют на ФЭК или делают предварительно 10 пробирок с разной степенью гемолиза равной взвеси эритроцитов:первая пробирка - 100 % гемолиз, вторая - 90 %, третья - 80 % и т.д. до 10 % гемолиза. Сравнивая пробирки, определяют 50 % гемолиз в опытном ряду.

Лизоцим Один из факторов общей резистентности организма. Фермент, оказывающий бактерицидное действие на кокковую микрофлору. Определение активности этого фермента проводят следующим образом. В 5 пробирок вносят 0,9 мл 0,85 % раствора хлорида натрия, а затем в первую пробирку вносят 0,1 мл лизоцима в разведении 1:10, перемешивают, после чего готовят 10-кратные разведения, путем переноса 0,1 мл раствора лизоцима из первой пробирки во вторую, после перемешивания, переносят 0,1 мл в третью и т.д. до разведения 1: 10000 (четвертая пробирка). Пятая пробирка - контроль (не содержит лизоцима). Во все пробирки вносят по 0,5 мл 1 млрд взвеси Micrococcus lisodeiecus или другой микроб. Смесь перемешивают и инкубируют в термостате при 370 С в течение 3 ч. Отмечают наибольшее разведение лизоцима, вызвавшее лизис микробов.

Метод Манчини (определение сывороточных иммуноглобулинов). На ровной плоской поверхности (стеклянная пластина, крышка от пластины для иммунологических реакций) создают слой геля, толщиной 1-2 мм, содержащий антисыворотку к определенному классу ИГ человека.

В геле штампуют лунки, которые затем заполняют испытуемыми сыворотками человека для определения количества иммуноглобулинов.

Пластины оставляют на 2-5 дней и учитывают результат. Молекулы иммуноглобулинов диффундируют в геле во все стороны и в месте оптимальной концентрации образуют кольцо преципитации - как результат реакции с антисывороткой. Диаметр кольца преципитации должен соответствовать количественному содержанию ИГ в исследуемой сыворотке.

Специальной линейкой измеряют наибольший диаметр кольца преципитации, а затем по таблицам определяют количество ИГ в исследуемой сыворотке. В норме содержание ИГ в сыворотке колеблется в пределах: IgM - 0,65-1,65 г/л, IgG - 7,50-15,45 г/л, IgA - 1,25-2,50 г/л.

РТМЛ – реакция торможения миграции лейкоцитов. РТМЛ основана на феномене подавления миграции лейкоцитов фактором, который выделяют сенсибилизированные лейкоциты при взаимодействии с чужеродным агентом.

Силиконизированные капилляры заполняют взвесью лейкоцитов крови, вводят в них клетки «чужака», центрифугируют в течение 5 мин при 1000 об. в мин, затем отламывают конец капилляра, не содержащего осадка клеток. Бактерии, вирусы и пр. агенты добавляют или в суспензию лейкоцитов или в инкубационную камеру. Капилляры помещают в камеру с питательной средой 199 и инкубируют при 37о С в течение 18-24 ч. Лейкоциты мигрируют из капилляра и образуют зону помутнения в среде. Площадь зоны помутнения проецируют на бумагу. Вычисляют индекс подавления миграции лейкоцитов агентом в сравнении с контрольной миграцией лейкоцитов без агента.

РБТЛ –реакция бласттрансформации лимфоцитов. Реакция основана на феномене активации лимфоцитов под влиянием стимула (митогена), с трансформацией их в бласты – большие делящиеся клетки. Этим определяется пролиферативная потенция лимфоцитов.

Свежую гепаринизированную кровь человека в количестве 0,6 мл разводят в 5 раз средой Игла с добавлением 20 мл (в концентрации 80 мкг/мл) глутамина и вносят по 100 мкл вместе с митогеном в 96-луночные планшеты для иммунологических реакций. В качестве мутагена можно использовать лаконос (PWM) в концентрации 5 мг/мл. Планшеты оставляют совместно с СО2 при 370 С на 72 ч, но за 16 ч до окончания инкубации вносят 5 мкг Ки/мл 3Н-тимидин. После завершения культивирования, клетки снимают с помощью харвестра на нитроцеллюлозные фильтры.

Уровень бласттрансформации лимфоцитов оценивают по интенсивности включения тимидина с помощью счетчика и жидкостного сцинцилятора и выражают в импульсах в мин. Индекс стимуляции рассчитывают из соотношений показателей митогениндуцированной и спонтанной бласттрансформации лимфоцитов.

Цитотоксический тест лимфоцитов. Лимфоциты периферической крови способны разрушать in vitro клетки-мишени как сенсибилизированные, та и не сенсибилизированные антителами. Это свойство лимфоцитов используют для оценки киллерной активности.

1. Оценка активности К-клеток. В качестве клеток-мишеней в данном тесте применяют эритроциты барана. К 0,1 мл 0,5 % взвеси нативных эритроцитов барана добавляют 0,01 мл суспензии лимфоцитов и инкубируют 3-4 ч при 37о С. Далее смесь центрифугируют при 500 об. в мин в течение 10 мин. Супернатант удаляют. Цитотоксическую активность определяют по выходу гемоглобина из лизированных клеток. К супернатанту добавляют 0,2 мл бензидина и 0,2 мл 3 % Н2О2. Далее на спектрофотометре определяют оптическую плотность жидкости.

2. Оценка активности естественных киллеров (NK-клеток). В качестве клеток-мишеней берут опухолевые клетки. В ячейки круглодонной пластины помещают 1-2. 104 меченых клеток-мишеней, к ним добавляют лимфоциты – 1-1,5.106 клеток в мл. Смесь инкубируют при 370 С в течение 4-14 ч. Активность естественных киллеров определяют по выделению в надосадок радиоактивного изотопа.

3. Цитотоксический тест. Можно установить факт присоединения антител к клеткам с помощью определения жизнеспособности клеток в цитотоксическом тесте.

В лунки панели типа Такачи для микротитрования вносят суспензию клеток, сыворотку к ним и комплемент. Инкубируют смесь при 37о С в течение 40 мин. Затем проводят окраску клеток трепановым синим, фиксируют их формальдегидом, переносят каплю смеси на предметное стекло и с использованием светового микроскопа определяют количество клеток, потерявших жизнеспособность, т.е. окрашенных. По сути – это реакция прямого гемолиза.

Определение ЦИК (циркулирующих иммунных комплексов). Сыворотку крови разводят 0,85 % раствором хлорида натрия 1 :25, смешивают с 7 % взвесью ПЭГ (полиэтиленгликоля) 1:1. Пробирки помещают в холодильник на 18 ч, затем центрифугируют 15 мин при 1500 об в мин, удаляют супернатант, а осадок растворяют в 2,5 мл 0,1 н раствора NaOH, тщательно его перемешивают, оставляют при комнатной температуре на 30 мин. Пробы замеряют на спектрофотографе с длиной волн 280 нм против 0,1 раствора NaOH. Уровни ЦИК выражают в ЕОП (единице оптической плотности). Уровни ЦИК в норме не должны превышать 0,110 ЕОП.

Второй способ. На культуре клеток линии Raji находятся рецепторы к С3 компоненту комплемента. При добавлении исследуемой пробы к этим клеткам иммунный комплексы, связанные с С3 компонентом будут фиксированы на клетках. Они выявляются с помощью меченых ферментом кроличьих антител к иммуноглобулинам сыворотки человека (по типу ИФА).

Определение поверхностных СD-антигенов

Реакция широко применяется, например, при обследовании ВИЧ-инфицированных, в диагностике иммунодефицита и пр. Разработаны разные модификации определения CD- антигенов. В основе метода лежит определение специфических маркеров лимфоцитов и других клеток, с помощью моноклональных антител. Например, Т-лимфоциты содержат СD3+, Т-хелпер (Т-индуктор) СD4+, Т-киллер и Т-супрессор СD8+, В-лимфоциты СD19+ и т.д.

Применяют моноклональные антитела, получаемые при слиянии миеломных клеток с плазматическими клетками, к одному из маркеров клеток. Полученные моноклональные антитела к одному из СD-антигенов, метят флюооресцеином, например, изотиоционатом, антитела к другому СD-антигену метят фикоэритритом. Смешивают такие моноклональные антитела с лимфоцитами и мазок помещают в люминисцентный микроскоп. Под действием света с длиной волны 488 нм первый краситель излучает зеленый цвет, а второй – оранжевый цвет. Возможно применение нового флюорохрома перидинина, излучающего красный цвет. Используя три флюорохрома возможно одновременное определение трех разных СD-антигенов в люминисцентном микроскопе.







Дата добавления: 2014-11-10; просмотров: 737. Нарушение авторских прав; Мы поможем в написании вашей работы!


Рекомендуемые страницы:


Studopedia.info - Студопедия - 2014-2022 год . (0.003 сек.) русская версия | украинская версия