Студопедия Главная Случайная страница Обратная связь

Разделы: Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

Генетика бактерий




Изменчивость бактерий обусловлена достаточно многочисленными процессами рекомбинаций и мутаций хромосом, а также за счет плазмид, транспозонов, Is-частиц и умеренных фагов. Изменчивость бактерий может быть наследуемой и приводить к появлению новых или исчезновению некоторых свойств бактерий. Мутации условно поделены на естественные и индуцированные, наводимые с помощью мутагенов

Индукция мутаций под воздействием ультрафиолетового облучения

В качестве источника УФ0 используют бактерицидную лампу ВУФ-15, устанавливают ее на расстоянии 60 см от центра облучения объекта. Облучение желательно проводить при красном цвете или в темноте.

Предварительно определяют бактерицидную дозу УФ-облучения, на основе которой устанавливают оптимальную мутационную дозу, равную 0,1-1,0 % от числа выживших бактерий.

Для получения lac-мутантов E.coli испытуемую культуру предварительно выращивают в питательном бульоне в течение 14-18 ч. Концентрация бактериальных клеток должна быть 2х108 в 1 мл. Клетки осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 40 мл 0,1 м раствора MgSO4 и охлаждают на льду для прекращения деления клеток. Суспензию в объеме 40 мл помещают в стерильную чашку Петри и облучают в течение 15 мин при 150 С. После этого клетки осаждают центрифугированием и ресуспендируют в питательном бульоне и делают несколько разведений.. Пробирки с питательным бульоном инкубируют при 370 С в течение 14-18 ч. Затем из разведений 10-2-10-5 по 0,1 мл высевают на плотную элективную питательную среду (в данном случае - Эндо) в чашки Петри и растирают шпателем.

Для выделения антибиотикорезистентных мутантов используют штамм E.coli В или К12, который высевают после облучения на минимальный агар с определенной концентрацией антибиотика (ампициллин 10 мг на 1 мл, левомицетин 5 мг на 1мл).

На среде Эндо lac-мутанты E.coli образуют бесцветные колонии. Клетки E.coli, которые выросли на среде с указанной концентрацией антибиотиков, являются резистентными к нему. Параллельно делают контрольные посевы этой же культуры без облучения.

Постановка опыта трансформации. Реципиент - Bacillus subtilis StrS (чувствитльный к стрептомицину). Донор - ДНК, выделенная из штамма Bacillus subtilis StrR (устойчивый к стрептомицину). Среда - питательный агар, содержащий 100 ED в 1 мл стрептомицина.

В пробирки к 1 мл бульонной реципиентной культуры B.subtilis добавляют ДНК донора (1 мкг на 1 мл) для их инкубации при 370 С в течение 30 мин. Далее в пробирки вносят 0,1 мг на мл раствора ДНКазы в 0,5 мл хлорида магния (для разрушения свободного ДНК) и выдерживают 5 мин. Для определения количества стрептомицин устойчивых бактерий, 0,1 мл неразведенной смеси засевают на питательную среду на чашки Петри. Для определения клеток реципиентной культуры из смеси готовят 10-ти кратные разведения в 0,85 % растворе хлорида натрия до 10-5-10-6 (для получения сосчитываемого количества колоний) и высевают по 0,1 мл на питательную среду без стрептомицина, а для контроля - на агар со стрептомицином. На последней среде реципиентная культура не должна расти. Посевы инкубируют при 370 С. На следующий день учитывают результаты. Определяют частоту трансформации по отношению количества выросших рекомбинантных колоний к числу колоний реципиентного штамма.

Постановка опыта по специфической трансдукции. Реципиент - штамм E.coli lac-, не имеющий В-галактозидазного оперона, контролирующего лактозу. Трансдуцирующий фаг - фаг dgal, в геноме которого часть генов замещена В-галактозидазным опероном E.coli. Он является дефектным, неспособным вызывать лизис кишечной палочки и обозначается как d(фаг dgal) с названием содержащегося в геноме бактериального оперона gal. Элективная среда - Эндо.

К 1 мл 1 ч бульонной культуры реципиентного штамма вносят 1 мл трансдуцирующего фага в концентрации 10-6-10-7 частиц в 1мл. Смесь инкубируют при 370 С в течение 60 мин, а затем готовят ряд десятикратных разведений культуры. Из пробирки с разведением культуры 10-6 делают высев по 0,1 мл на три чашки Петри со средой Эндо. Посевы инкубируют сутки, затем учитывают результат и вычисляют величину трансформации. Например, после посева 0,1 мл культуры в разведении 10-6 на трех чашках, где выросло соответственно, 138, 170, 160 бесцветных колоний реципиентного штамма, а на 1 и третьей чашках выросли колонии красного цвета, следовательно, частота трансдукции:

(5+1)х10х106х (138+170+160):10х106 = 6 :468 = 1.10-2

Постановка опыта конъюгации с передачей R-плазмиды. Плазмида контролирует множественную устойчивость к антибиотикам: Str, Tcn, Cmc (стрептомицин, тетрациклин, хлорамфеникол). Донор - штамм E.coli K12 R+leu-StrRТcnRCmcR. Реципиент штамм E.coli K12 R-leu-StrSTcnSCmcS. Cреда минимальная глюкозо-солевая, содержащая эти антибиотики в концентрации 50 мкг в 1мл каждый.

В стерильную пробирку вносят по 1 мл 3-х ч бульонной культуры реципиента и донора. Смесь инкубируют при 370 С в течение 2 ч и высевают в объеме 0,1 мл в чашки с элективной средой, где вырастают резистентные штаммы. Отсутствие роста донора можно объяснить потребностью в лейцине, а роста реципиента - в чувствительности к антибиотикам. Частоту образования трансконъюгантов определяют отношением их к числу реципиентных клеток. Например, при высеве 0,1 мл культуры реципиентного штамма в разведении 10-4 на глюкозо-солевую среду с лейцином получено 20 колоний, а при высеве смеси - 60 колоний трансконъюгантов. Частота формирования трансконъюгантов:

(60х10) : (20 х 10х104) = 60х102 : 2х106 = 3,0.10-4

Определение колициногенных факторов (col-плазмида). Исследуемые культуры E.coli засевают методом укола в питательную среду в чашки Петри (7-8 уколов в чашке). Посевы инкубируют при 370 С в течение суток. после чего на внутреннюю поверхность чашек Петри помещают кусочки ваты, смоченные хлороформом, в парах которого погибают бактерии.

По поверхности агара равномерно распределяют 3 мл расплавленного агара, который смешан с 0,2 мл часовой бульонной индикаторной культуры (чувствительной к данному колицину E.coli). Через 18-20 ч инкубации культуры появляются результаты опыта. Среди посевов индикаторной культуры появляются прозрачные зоны, соответствующие посевам исследуемой культуры.

Определение колицинотипа. В питательный агар в чашках Петри методом укола засевают эталонные штаммы бактерий с известным колицином. Посевы инкубируют при 370 С сутки, после чего культуру убивают хлорамином. Затем по поверхности питательной среды в чашках Петри распределяют 3 мл расплавленного агара, смешанного с 0,2 мл 4-х часовой культурой E.coli неизвестного колицинотипа. Через 18-20 ч культивирования при 37о С отмечают результаты действия колицина. Если вокруг посевов эталонного штамма появляются зоны просветления в росте исследуемой культуры, то это не будут идентичными колициногенами. В идентичной по колицинам культуре зон просветлений не будет.


Поможем в написании учебной работы
Поможем с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой





Дата добавления: 2014-11-10; просмотров: 1145. Нарушение авторских прав; Мы поможем в написании вашей работы!

Studopedia.info - Студопедия - 2014-2022 год . (0.02 сек.) русская версия | украинская версия
Поможем в написании
> Курсовые, контрольные, дипломные и другие работы со скидкой до 25%
3 569 лучших специалисов, готовы оказать помощь 24/7