Студопедия Главная Случайная страница Обратная связь

Разделы: Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

Методы культивирования вирусов




Вирусы не способны к бинарному делению. Они как облигатные внутриклеточные паразиты, требуют для культивирования живые клетки. Это могут быть культуры клеток, куриные эмбрионы, мыши-сосунки и пр.

Культуры клеток. Культуры клеток впервые применили в 20-е годы прошлого столетия. Но только в 1949 г было экспериментально показано, что культуры клеток поддерживают рост вируса полиомиэлита.

Культуры клеток готовят из тканей животных или человека. Культуры подразделяются на первичные (неперевиваемые), полуперевиваемые и перевиваемые.

Наилучшими являются клетки перевиваемые, позволяющие проводить достаточно много пассажей.

Перевиваемые однослойные культуры клеток готовят из злокачественных и нормальных линий клеток, обладающих способностью к делению и длительному размножению in vitro в определенных условиях. К ним относятся злокачественные клетки Hela, предварительно выделенные из карциномы шейки матки, Hep-3 - из лимфойдной карциномы и нормальные клетки амниона человека, почек обезьян и др.

К полуперевиваемым культурам относят диплойдные клетки человека, представляющие собой клеточную систему, позволяющую проводить до 40-50 пассажей. Диплойдные клетки не претерпевают злокачественного перерождения, чем и отличаются от злокачественных.

Взвесь дезинтегрированных клеток ткани в растворе Хенкса или 199 вносят в чашку Петри (флакон) и оставляют на сутки при комнатной температуре. За это время к стеклу дна прикрепляется монослой клеток, остальные не связавшиеся клетки следует отмывать этими же растворами. Монослой культуры клеток заражают исследуемым материалом, который содержит вирусы. На размножение в культуре клеток вируса указывает цитопатическое действие его на клетки (ЦПД).

ЦПД следует выявлять с помощью методов микроскопии по изменению морфологии данной культуры клеток. Культивирование миксовирусов приводит к слиянию клеток, с образованием синтиция, реовирусы сморщивают и деструктируют клетки. Аденовирусы - агрегируют клетки. Вирусы кори, паротита и парагриппа индуцируют образование гигантских клеток - многоядерных. Риновирусы вызывают образование отдельных участков округлых клеток с отростками.

Некоторые вирусы (краснуха) не вызывают видимых ЦПД, но их определяют по интерференции другого вируса, который обладает способностью вызывать дегенерацию инфицированных клеток. ЦПД вирусов просматривают в динамике. Энтеровирусы могут вызывать ЦПД на 1-2 сутки, другие вирусы на 4-6 сутки.

Индикацию вирусов в культуре клеток проводят методами:гемагглютинации, ИФА, гемадсорбции, нейтрализации и пр.

Метод гемадсорбции предполагает внесение в культуру клеток, зараженную вирусом, взвесь эритроцитов. После отмывания культуры клеток 85 % раствором хлорида натрия все эритроциты, кроме адсорбированных на поверхности пораженных клеток, отмываются.

Более точным количественным методом учета отдельных вирусных частиц является метод негативных бляшек Дюльбеко. Культуру клеток заражают вирусом и покрывают тонким слоем агара. После инкубации на поверхности агара появляются просветленные участки определенной формы (бляшки) на розовом фоне, представляющие собой участки погибших клеток в сплошном монослое культуры клеток. Титр вируса выражается числом бляшкообразующих единиц (БОЕ) в 1 мл.

Куриные эмбрионы. Для получения разных препаратов или чистых культур вирусов используют 8-12 дневные куриные эмбрионы. Куриные эмбрионы в условиях асептики заражают в 3 полости: амниотическую, алантоисную и желточный мешок.

Скорлупу над воздушной камерой обрабатывают 70 % спиртом и обжигают, а затем протирают скорлупу 2 % раствором йода.

Для заражения в алантоисную полость в скорлупе над воздухом проделывают отверстие. Шприцем вводят в него 0,1-0,2 мл вируссодержащего материала на глубину 2-3 см дальше воздушной подушки. Отверстие в скорлупе заливают парафином.

Заражение в хорион-алантоисную оболочку. Используют эмбрионы 10-12 дневного возраста. Яйцо просвечивают в свете и выбирают бессосудистую область, отмечают локализацию воздушного мешка. Делают искусственный мешок над отмеченным местом, затем снимают скорлупу острым инструментом, освобождают наружную оболочку, которую отслаивают осторожным надавливанием. Делают второе отверстие у края воздушного мешка. Через это отверстие отсасывают воздух и хорион-алантоисная оболочка отслаивается от наружной оболочки. Заражение вируссодержащим материалом (0,1-0,2 мл) делают в оболочку хорион-алантоиса.

Заражение в амниотическую полость. Используют 7-14 дневные куриные эмбрионы. После отслоения хорион-алантоисной оболочки, расширяют отверстие с помощью пинцета, захватывая амниотическую оболочку. Ее выводят через хорион-алантоисную оболочку. Инокулят вводят через эту оболочку непосредственно в амниотическую полость.

Заражение в желточный мешок. Используют 3-8 дневные эмбрионы. В этом возрасте желточный мешок занимает почти всю полость яйца.

Скорлупа обрабатывается как описано выше, делают отверстие в воздушном мешке и вируссодержащий материал вводят в мешок желточный, непосредственно.

Наблюдения за эмбрионами начинают вести через 24-48 ч инкубации при 370 С.

Вскрытие куриного эмбриона производят через 48-72 ч инкубации при 370 С. После обработки спиртом и 2 % раствором йода скорлупу рассекают ножницами немного выше границы воздушной камеры, наклоняя яйцо, чтобы скорлупа не попала в полость

Снимают оболочку и рассматривают хорион-алантоисную оболочку, отмечая очаги поражения.

После вскрытия алантоисной оболочки отсасывают алантоисную жидкость, разливают в пробирки или лунки полистироловых планшет по 0,5 мл. Затем добавляют 0,2 мл 1 % взвеси суспензии отмытых куриных эритроцитов, выдерживают при комнатной температуре до 1 ч.

Учитывают результаты реакции: выраженная гемагглютинация - на ++++ креста, тонкая пленка склеившихся эритроцитов +++, наличие просветов в пленке ++, хлопьевидный осадок (-). Наличие гемагглютинации указывает на присутствие вируса в исследуемом материале.

Лабораторные животные. В основу открытия первых вирусов был положен принцип фильтруемости через бактериальные фильтры (1902).

Макс Тейлор положил начало современному этапу работ в вирусологии, основанное на использовании животных - мышей. В 1948 г Долдофор и Сойклаз применили в работе с вирусами мышей-сосунков.

Для лабораторных исследований обычно применяют белых мышей-сосунков.

А также крыс хлопковых, кроликов, хомяков, обезьян и пр.

Сущность метода состоит в возможности выделения тех вирусов, которые плохо репродуцируются в эмбрионах или культуре клеток.

К недостаткам относят возможность контаминации животных другими инфекциями, а также не последующее заражение культур клеток для выделения чистой культуры.

Подготовка материала. Жидкие материалы, не содержащие в норме бактерий (кровь, спинномозговая жидкость, сыворотка) могут быть использованы для заражения животных в нативном виде.

Ткани промывают в стерильной воде, нарезают на мелкие куски и измельчают. Затем добавляют растворитель до 10-20 % взвеси. Суспензию центрифугируют при 2000 оборотов в мин в течение 10 мин. Для заражения используют надосадок.

Если материал содержит бактерии (носоглоточные смывы, фекалии, насекомые и пр.), то они должны быть удалены: с помощью антибиотиков, фильтрования через фарфоровые свечи, дифференциального ультрацентрифугирования и пр.

Экспериментальное заражение животных

Экспериментальное заражение животных в лабораторной практике имеет большое значение. Перед опытом их взвешивают, измеряют температуру.

Заражение животных интрацеребральное. Применяют для выделения нейротропных вирусов. Мышей заражают группами по 6 штук, перед заражением их наркотизируют и материал в количестве 0,03 мл вводят в мозг, несколько выше орбитального бугра. За ними ведут наблюдение 2-4 недели. Если животные погибают за этот срок, то мозг и кровь из сердца подвергают бактериологическому исследованию для исключения бактериального загрязнения. Выживших животных забивают и исследуют органы на вирусы.

Интраназальное заражение животных. Наркотизируют животных, материал вводят с помощью капиллярной пипетки в носовые ходы каплями. В дальнейшем получают органы погибших или забитых животных и исследуют их вирусологическими и др. методами, включая гистологию срезов органов.

Подкожный способ заражения. Место инъекции дезинфицируют, предварительно удалив волосы. Кожу захватывают в складку, вводят в нее иглу и медленно впрыскивают материал. Затем складку отпускают, накладывают на место укола вату, смоченную в дез.растворе, быстро извлекают иглу. Уколы делают в область бедра (кроликам), мышам и крысам - в поясницу у корня хвоста.

При внутримышечном способе материал вводят кроликам в мышцу бедра.

Внутрикожный способ. В толщу кожи вводят 0,1-0,2 мл материала туберкулиновым шприцем. На месте введения образуется пузырь.

Внутрибрюшинный способ. Животное держат вниз головой, инъекцию тупой иглой делают в нижнюю часть живота, сбоку от средней линии. Сначала вводят иглу под острым углом, проколов кожу, иглу поворачивают под прямым углом. Толчкообразным движением прокалывают брюшную стенку, при этом ощущается провал в полость.

Внутривенное введение. Кроликам вводят материал в ушную вену. Сдавливают корень уха, чтобы набухли вены. Можно потереть кожу ксилолом и вены будут виднее. После прокола вены иглой, сдавливание корня уха прекращают, жидкость медленно вливают в вену.

Вскрытие животных. Животное умерщвляют эфиром или хлороформом.

В противочумной практике их опускают при помощи щипцов в дез.раствор для уничтожения эктопаразитов и обезвреживания кожи, вынимают и кладут на сетку, чтобы стекал дез.раствор, а затем переносят животное на препаровальный столик. Мышей и морских свинок вскрывают на доске.

Ножницами разрезают кожу от лобка до нижней челюсти и делают разрезы к лапкам. Кожу отпрепаровывают и осматривают.

Паховые лимфоузлы, отрезают часть от них и делают мазок-отпечаток на предметное стекло, а остальную часть засевают в бульон. Делают разрез ножницами грудной клетки, захватив пинцетом отросток мечевидный, ребра прорезают с обеих сторон и перерезают ключичные кости. Осматривают лимфоузлы, легкие, сердце. Часть органов захватывают пинцетом и отрезают, разрезанной поверхностью делают мазки-отпечатки и засевают кусочек органа в жидкие питательные среды. Далее приподнимают пинцетом брюшину у нижнего края и разрезают ножницами снизу вверх.

Проводят осмотр органов и лимфоузлов, а затем с помощью пинцета и ножниц отрезают кусочки органов, делают мазки-отпечатки и кусочки засевают в жидкие питательные среды.

Животных после вскрытия, павших либо погибших во время опыта, следует автоклавировать или сжигать в крематории. Зараженные банки, где держали грызунов, следует обработать 10 % хлорной известью. Подстилку и остатки корма сжигают.







Дата добавления: 2014-11-10; просмотров: 2184. Нарушение авторских прав; Мы поможем в написании вашей работы!


Рекомендуемые страницы:


Studopedia.info - Студопедия - 2014-2021 год . (0.005 сек.) русская версия | украинская версия